小鼠髓样抑制细胞体外扩增及Notch信号分子表达分析

摘要

目的:
　　髓样抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一群来源于髓样祖细胞的异质性细胞，具有未成熟细胞的表型和免疫抑制功能。多年来研究发现Notch信号通路与多种血细胞的发育、分化增殖和凋亡密切相关。本研究的目的是探讨体外诱导小鼠MDSC扩增的方法及影响因素，并进一步分析体外扩增的MDSC Notch信号分子的表达情况，以期为探究MDSC的体外扩增机制及研究MDSC相关疾病的发病机理提供新的思路。
　　方法:
　　(1)探寻MDSC体外扩增的最佳细胞因子浓度。实验分为五组，分别采用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6、20ng/ml GM-CSF和20ng/mlIL-6、40ng/ml GM-CSF和40ng/ml IL-6、10ng/ml GM-CSF、10ng/mlIL-6刺激2.5×105个/ml的新鲜骨髓细胞培养4d，流式细胞术检测MDSC和MDSC亚群(粒细胞样MDSC: PMN-MDSC和单核细胞样MDSC: MO-MDSC)的比例，并计数MDSC的绝对数。根据实验结果选取出MDSC体外扩增的最佳细胞因子浓度。
　　(2)探寻MDSC体外扩增的最佳培养时间。实验分为两组，使用10ng/mlGM-CSF和10ng/ml IL-6刺激2.5×105个/ml的新鲜骨髓细胞分别培养2d和4d，流式细胞术检测MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并计数MDSC的绝对数。根据实验结果选取出MDSC体外扩增的最佳培养时间。
　　(3)探寻MDSC体外扩增的最佳新鲜骨髓细胞浓度。实验分为三组，使用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6分别刺激1×105个/ml、2.5×105个/ml、5×105个/ml新鲜骨髓细胞培养4d，流式细胞术检测MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并计数MDSC的绝对数。根据实验结果选取出MDSC体外扩增的最佳新鲜骨髓细胞浓度。
　　(4)采用实时荧光定量PCR和Western blot检测体外扩增的MDSC Notch信号分子的表达。
　　结果:
　　(1)小鼠MDSC体外扩增的影响因素有:细胞因子刺激浓度、培养时间、新鲜骨髓细胞浓度。
　　①细胞因子联合刺激组MDSC的比例均显著高于新鲜骨髓细胞未刺激组和单独GM-CSF或IL-6刺激组（P均＜0.05），但三组之间未见明显差异。五组不同浓度细胞因子刺激组PMN-MDSC的比例均显著低于新鲜骨髓细胞未刺激组（P均＜0.05），而MO-MDSC的比例则显著高于新鲜骨髓细胞未刺激组（P均＜0.05）。提示10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6是最佳细胞因子浓度组合。
　　②其他培养条件固定时，培养4d的MDSC比例和绝对数均明显高于培养2d的比例（P均＜0.05）。但两组间PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未见明显差异（P均＞0.05）。提示4d是最佳培养时间。
　　③其他培养条件固定时，骨髓细胞浓度为2.5×105个/ml组诱导的MDSC比例和绝对数均显著高于其他两个细胞浓度组（1×105个/ml、2.5×105个/ml）（P均＜0.05）。但三组间PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未见明显差异（P均＞0.05）。提示2.5×105个/ml是最佳新鲜骨髓细胞浓度。
　　(2)MDSC体外扩增体系中Notch信号相关分子的表达情况。
　　与新鲜骨髓细胞相比，MDSC体外扩增体系中Notch信号相关受体 Notch3的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P均＜0.05），而Notch1、Notch2和Notch4表达水平无明显差异P均＞0.05）;Notch信号相关配体Jaggedl mRNA的表达水平明显增高(P＜0.05)，Dll1和Dll4的表达水平则显著下降（P均＜0.05），而Jagged2的表达水平未见明显差异(P＞0.05);Notch信号通路中下游活化靶基因Hes1 mRNA的表达水平也显著低于新鲜骨髓细胞(P＜0.05)，而Hes5和Hey1的表达水平无明显差异（P均＞0.05）。
　　结论:
　　本研究成功建立小鼠MDSC的体外扩增体系。在MDSC的体外扩增体系中Notch信号下调。该结果为进一步研究MDSC体外扩增的机制及其在肿瘤、慢性炎症等疾病中的免疫调节作用提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一章 绪论

1．1 MDSC概述

1．1．1 MDSC的定义

1．1．2 MDSC的来源和亚群

1．1．3 MDSC的扩增和活化

1．1．4 MDSC的免疫抑制功能

1．1．5 MDSC与疾病

1．2 Notch信号通路

1．3 本论文研究的目的、方法及意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究方法

1．3．3 实验设计

1．3．4 本研究的意义

第二章 小鼠髓样抑制细胞体外扩增体系的建立

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 其他试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 小鼠新鲜骨髓细胞悬液的制备

2．2．2 小鼠新鲜骨髓细胞的体外培养

2．2．3 流式细胞术检测培养后细胞的MDSC比例

2．2．4 流式细胞术检测培养后细胞MDSC亚群(PMN-MDSC和MO-MDSC)的比例

2．2．5 数据处理和统计学分析

2．3 结果

2．3．1 细胞因子浓度对MDSC扩增的影响

2．3．2 刺激时间对MDSC扩增的影响

2．3．3 骨髓细胞浓度对MDSC扩增的影响

2．4 讨论

第三章 MDSC Notch分子表达分析

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 其他试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 小鼠MDSC的体外扩增

3．2．2 qRT-PCR检测Notch受体、配体、靶基因mRNA的表达

3．2．3 Western blot检测Noteh3蛋白的表达

3．2．4 数据处理和统计学分析

3．3 结果

3．3．1 MDSC扩增体系中Notch受体的表达

3．3．2 MDSC扩增体系中Notch配体的表达

3．3．3 MDSC扩增体系中Notch信号通路下游靶基因的表达

3．4 讨论

第四章 主要结论与展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和参加的学术会议