孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落组成的解析及新型HPV鉴定

摘要

人体体表及与外界相通的腔道内寄居着大量的不同类型的微生物，不同个体及身体不同部位含有不同的微生物群落。阴道感染会导致女性特别是孕妇进一步的并发症如早产、产后感染、盆腔炎等疾病，增加致病性病毒、细菌及真菌感染的风险。另外，女性怀孕时如患有阴道炎会影响精子质量，严重的情况下甚至可以导致不孕；即使怀孕，孕期也极易引起宫内感染、产道感染等，进而感染胎儿、新生儿，造成流产、早产、先天发育畸形或智力低下等严重的后果。目前，国内外多数研究针对的都是阴道内细菌群落的组成、分布及其与女性相关疾病如阴道炎的联系，而对阴道微环境内病毒群落的研究较少。作为阴道微生物类群的重要成员，阴道内病毒群落的种类和分布对于女性特别是孕妇群体的健康有重要意义。探讨阴道内复杂的病毒群落的组成及其与孕期妇女的健康和疾病的关系，探讨特定生理病理条件下阴道微环境内病毒群落的组成及其变化可以为相关疾病的诊断、治疗奠定理论基础。
　　妊娠期妇女传统的细菌及病毒性感染可使用有效的抗生素、疫苗或抗体以达到治疗和预防的目的，因此我们对传统的妊娠期妇女阴道细菌及病毒性感染并不恐慌，而暂未被发现的新型病毒则可能是引起未知病因妊娠期妇女的宫内感染、产道感染等继而感染胎儿、新生儿，造成流产、早产等严重后果的罪魁祸首。提前挖掘潜在的致病性新病毒将是人类征服新发病毒性传染病的最好选择。
　　病毒宏基因组学（Viral Metagenomics）是近年出现的病毒检测新方法，该方法突破了只能检测已知病毒的传统病毒检测方法的局限性，直接以生物样本中的所有病毒核酸为研究对象，不但可以有效地鉴定出存在的已知病毒，还可以迅速发现各种未知新型病毒。因此，本研究以患有阴道炎的孕期妇女为研究对象，采用病毒宏基因组学方法，在解析孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落组成的基础上鉴定新型潜在致病性病毒、探讨新型病毒的分子起源及进化并研究新型病毒与疾病的相关性，从而为妊娠期妇女产道新型病毒感染的预防及临床治疗等提供理论基础和技术支持。
　　本研究主要内容和结果如下：
　　(一)孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落组成分析
　　本研究从镇江市妇幼保健医院采集总计88份患有阴道炎孕期妇女的阴道分泌物拭子样品，基于Illumina Miseq测序平台建立病毒宏基因组二代测序文库。通过Miseq测序平台深度测序获得原始病毒核酸数据，利用基于病毒宏基因组学技术的生物信息学技术分析平台，对原始高通量测序数据进行生物信息学分析，获取文库中存在的所有可能的病毒基因序列，对孕妇阴道炎微环境内病毒群落的组成进行分析。结果显示孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落中各种类型病毒基因序列数由多到少组成为：乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）81.62%、指环病毒科（Anelloviridae）13.36%、未分类病毒（Unclassified）1.03%、人类内源性逆转录病毒科（HERV）0.85%、细小病毒科（Parvoviridae）0.62%、杯状病毒科（Caliciviridae）0.51%、藻类 DNA病毒科（Phycodnaviridae）0.40%、小RNA病毒科（Picornaviridae）0.23%、Mimiviridae病毒科0.20%、其它病毒科（Others）1.18%。
　　孕妇阴道炎微环境内病毒群落的组成具有以下特点：
　　（1）病毒群落组成呈现病毒种类多样性，其真核病毒类型包含至少30个病毒科或类群。
　　（2）人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）构成了孕妇阴道炎微环境内病毒群落的主体。通过对乳头瘤病毒进一步按种和型进行分类，发现孕妇阴道炎微环境内HPV种类丰富，且滴度较高，包括HPV16、HPV52等各种高危型别和HPV6、HPV42等各种低危型别。其中序列数最多的是Alphapapillomavirus14种中的HPV71，占HPV序列总数的38.64%。
　　（3）阴道炎微环境内病毒群落中含有多种潜在人体致病性病毒，如指环病毒、杯状病毒、细小病毒及小RNA病毒等。
　　（二）新型HPV的发现及其遗传特征研究
　　通过对孕妇阴道炎微环境内病毒群落的分析，结合基于病毒基因序列的系统发育分析，本研究发现编号为KYD08的病毒文库内含有11个contig，其与GenBank内提交的HPV序列具有较低的相似度，可能是新型HPV毒株。根据该11个contig中的最大片段，本研究设计了一对套式PCR检测引物，对该文库内15个阴道拭子样品进行PCR筛查，发现该文库中编号为52号的样品为阳性。为了获取该新型HPV的全基因组序列，本研究基于宏基因组文库内的11个HPV contig序列，设计了8对套式引物进行巢式PCR扩增各contig之间的gap序列，最终获得了该新型HPV的全基因组序列。该HPV毒株命名为HPV-ZJ01，并将该毒株序列登录GenBank，获得GenBank登录号为KX082661。基因组序列分析显示，HPV-ZJ01全基因组为7358bp，由6个开放性阅读框（E6、E7、E1、E2、L2和L1）和一个非编码区（LCR）组成。基于HPV-ZJ01和相关代表性HPV的L1蛋白及全基因组的系统进化分析结果均显示HPV-ZJ01与Gamma属19种的成员HPV161、HPV162和HPV166聚集。在L1基因水平上，HPV-ZJ01与HPV161的核苷酸同源性是71.1%，根据国际病毒分类委员会（ICTV）的规定，乳头瘤病毒同一种中各成员基于L1基因上的核苷酸同源性在71-89%。以上进化分析表明HPV-ZJ01是属于Gamma-19种的新型HPV。
　　（三）新型HPV与孕妇阴道炎及女性宫颈癌相关性初步研究
　　为了初步探讨本研究发现的新型HPV与孕妇阴道炎及女性宫颈癌的相关性，本研究进一步采集了镇江地区128份女性宫颈癌样品，加上本研究中的88份患有阴道炎孕妇的阴道分泌物拭子样品，采用基于HPV-ZJ01序列设计的套式PCR检测方法，对患有阴道炎孕妇的阴道分泌物拭子及女性宫颈癌样品进行该新型HPV的PCR筛查，结果显示88个患有阴道炎孕期妇女的阴道分泌物拭子及另外收集的128份女性宫颈癌样品中，除之前阳性病毒文库中的52号样品是阳性外，其它标本均是阴性。该结果初步提示本研究发现的新型HPV毒株与孕妇阴道炎和女性宫颈癌无较大相关性，其致病性有待于进一步基于更大样品量的分子流行病学研究。
　　结论：
　　（1）运用病毒宏基因组学方法解析了孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落的组成；
　　（2）孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落呈现病毒种类多样性并含有多种致病性病毒；
　　（3）孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落中发现了一株新型HPV，其属于乳头瘤病毒Gamma-19种的一个新基因型；
　　（4）该新型HPV与阴道炎和宫颈癌可能无相关性。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 绪论

1.1 病毒宏基因组学概念

1.2 病毒宏基因组学的应用

1.3 病毒宏基因组学的研究方法

1.3.1 样品处理

1.3.2 DNA文库的构建

1.3.3 DNA文库的测序

1.3.4 文库测序结果分析

1.4 病毒宏基因组学的研究现状及发展趋势

1.5研究目的与意义

1.6 本研究的总体技术路线

第二章 孕期妇女阴道炎微环境内病毒群落的组成

2.1材料与方法

2.1.1阴道炎孕期妇女阴道分泌物样品的采集

2.1.2主要实验试剂及耗材

2.1.3 阴道炎孕期妇女阴道分泌物的前处理

2.1.4 样品组合设计

2.1.5 阴道炎孕期妇女阴道分泌物样品的核酸酶消化

2.1.6 病毒核酸的提取

2.1.7 逆转录及合成双链DNA

2.1.8 高通量测序文库的构建

2.1.9文库的扩增

2.1.10 文库的纯化

2.1.11 病毒文库质量的检测

2.1.12 文库的Miseq深度测序

2.1.13 文库测序结果的生物信息学分析

2.2文库质量检测与结果分析

2.2.1 病毒宏基因组DNA文库的质量检测

2.2.2 Miseq测序质量

2.2.3 孕期妇女阴道分泌物病毒宏基因组学分析结果

2.3 讨论

第三章 新型Human papillomavirus的研究

3.1材料和方法

3.1.1 样品采集

3.1.2 病毒核酸的提取

3.1.3 引物设计及全基因组扩增

3.1.4 PCR产物的电泳检测

3.1.5 PCR产物目的条带的胶回收

3.1.6病毒目的基因的T/A连接

3.1.7 感受态细胞的制备

3.1.8 连接产物转化感受态细菌及培养

3.1.9 序列拼接

3.1.10 新型HPV基因结构分析

3.1.11 基于病毒L1蛋白和全基因组的系统进化分析

3.1.12 HPV-ZJ01的PCR筛查

3.2 实验结果

3.2.1 阳性样品检测结果

3.2.2 HPV-ZJ01全基因组扩增

3.2.3 病毒基因组结构分析

3.2.4 HPV-ZJ01的序列及系统进化分析

3.2.5 HPV-ZJ01的PCR筛查

3.3 讨论

第四章 主要结论及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表学术论文、参与课题及参加会议

一. 发表论文

二．参与课题

三．参加学术会议