LncRNA ZFAS1在胃癌中的作用和诊断价值研究

摘要

目的：检测长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）锌指结构反义转录本1(zinc finger antisense1, ZFAS1)在胃癌患者肿瘤组织、血清及血清外泌体(exosome)中的表达水平，分析其与临床病理指标的相关性，探讨 ZFAS1在胃癌发生发展中的作用及机制，为胃癌提供新的诊断标志物和治疗靶点。
　　方法：
　　1、结合生物信息学分析和文献检索选择10种肿瘤相关lncRNA(CCAT1、MALAT1、PVT1、HULC、GAS5、MYCLO-2、ZFAS1、lncRNA-ATB、HOTTIP、lincRNA-p21)，采用实时荧光定量RT-PCR筛选在胃癌细胞中表达显著改变（倍数≥2）的lncRNA。
　　2、采用实时荧光定量RT-PCR检测ZFAS1在胃癌患者肿瘤组织、血清及血清外泌体中的表达水平，结合患者的临床病理资料，统计分析ZFAS1表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期等病理因素之间的相关性；分析 ZFAS1在血清中的稳定性，探讨其潜在诊断价值。
　　3、采用质粒介导 shRNA干扰 ZFAS1在胃癌细胞 MGC-803和BGC-823中表达，ZFAS1过表达质粒转染MKN-28胃癌细胞，实时荧光定量RT-PCR检测shRNA干扰和过表达效率；生长曲线和克隆形成实验检测干扰和过表达后细胞增殖能力；Transwell迁移实验检测干扰和过表达后细胞迁移能力；流式细胞术检测处理后细胞周期和细胞凋亡变化；实时荧光定量RT-PCR和western blot检测ZFAS1对细胞增殖和迁移相关基因及蛋白表达的影响。
　　4、提取胃癌细胞BGC-823来源的外泌体，采用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）、western blot鉴定外泌体；采用外泌体处理MKN-28细胞，实时荧光定量RT-PCR检测处理后ZFAS1表达水平；生长曲线和克隆形成实验检测外泌体处理后细胞的增殖能力；Transwell迁移实验检测处理后细胞的迁移能力；流式细胞术检测细胞周期的变化；实时荧光定量RT-PCR和western blot检测处理后细胞增殖、迁移相关基因及蛋白表达的变化。
　　结果：
　　1、实时荧光定量RT-PCR检测结果表明ZFAS1表达在胃癌患者肿瘤组织、血清以及血清外泌体中显著增加，并且在血清中稳定存在。
　　2、病理相关性分析结果表明胃癌患者肿瘤组织、血清及血清外泌体中ZFAS1高表达均与淋巴结转移、TNM分期显著相关（P?0.05）。
　　3、shRNA干扰后ZFAS1表达降低，过表达后ZFAS1表达增加；干扰和过表达实验结果表明 ZFAS1能促进细胞周期进程，抑制细胞凋亡，诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），从而增强胃癌细胞增殖和迁移能力。
　　4、透射电镜显示外泌体呈椭圆形双层膜囊泡结构，纳米颗粒跟踪分析显示外泌体的大小为50-150nm，浓度为1.0×1011~2.5×1011微粒/毫升，western blot结果表明外泌体含有丰富的CD9和CD81，流式细胞仪检测结果显示MKN-28细胞具有较强的外泌体内吞能力。
　　5、外泌体处理后，ZFAS1在MKN-28细胞中表达显著增加，MKN-28细胞增殖和迁移能力增强，处于S期的细胞比例增加，MKN-28细胞中cyclin D1、Bcl-2、N-cadherin、Slug、Snail、Twist、ZEB1表达增加，Bax、E-cadherin表达降低，细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinas, ERK）无明显改变，而磷酸化ERK（p-ERK）表达增加。
　　结论：ZFAS1在胃癌患者肿瘤组织、血清和血清外泌体中高表达，且表达水平与淋巴结转移和TNM分期显著相关；ZFAS1能加快细胞周期进程，抑制细胞凋亡，诱导EMT发生，促进胃癌细胞增殖和迁移；外泌体能通过转运ZFAS1促进胃癌恶性进展。因此，ZFAS1有望成为胃癌诊断和治疗的新分子标志物。

目录

第一章 绪论

1.1 长链非编码RNA

1.2 LncRNA与胃癌

1.3 LncRNA与外泌体

1.4 LncRNA锌指结构反义转录本1概述

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1 研究目的

2.2 实验设计方案及技术路线

2.3 研究意义

第三章 ZFAS1在胃癌中的表达及临床意义分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 ZFAS1对胃癌细胞增殖和迁移的影响

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 胃癌细胞来源外泌体ZFAS1对胃癌细胞增殖和迁移的影响

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间科研成果及参加会议

一、科研成果

二、参加会议