外源性硫化氢对丙烯腈诱导的大鼠星形胶质细胞毒性的影响及其机制研究

摘要

目的：
　　硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)作为继CO、NO后的第三种气体信号分子，有着重要的神经保护性和神经调节作用，在保护化学物和药物的神经损伤的应用中有着广阔前景。丙烯腈(acrylonitrile,AN)是一种高毒的有机腈，易经呼吸道、皮肤和胃肠道侵入人体，主要侵害神经系统。我们前期研究已经发现AN神经毒性与硫化氢、谷胱甘肽等含硫化合物代谢密切相关，因此，本实验以大鼠原代星形胶质细胞为研究对象，硫氢化钠(NaHS)为外源性H2S供体：
　　1.初步探索外源性H2S对AN诱导的星形胶质细胞毒性的影响；
　　2.进一步探索外源性H2S对AN诱导的细胞毒性影响的调控机制；
　　3.为研发新的丙烯腈预防和治疗药物提供科学依据，以期寻找新的解毒方向。
　　方法：
　　1.采用AN处理原代培养的星形胶质细胞，NaHS为外源性H2S供体预处理细胞1 h。MTT法检测细胞活力和LDH漏出率检测细胞毒性评价NaHS对AN诱导的细胞毒性的影响。检测GSH和ROS含量的变化评价细胞氧化应激水平的改变。
　　2.单纯应用NaHS处理细胞，检测自噬相关蛋白Beclin1、SQSTM1/P62、Atg5表达变化，免疫荧光方法观察星形胶质细胞中自噬颗粒变化，吖啶橙染色检测细胞酸性自噬泡，自噬双标腺病毒检测自噬流等方法检测NaHS对原代星形胶质细胞自噬水平的影响。
　　3.单独应用 NaHS处理细胞，采用细胞核质蛋白分离，免疫印迹法检测Nrf2、HO-1、γ-GCS的表达以及免疫荧光标记Nrf2观察其核转位情况来综合评价NaHS对细胞Nrf2/ARE信号通路的影响。
　　4.通过自噬抑制剂和siRNA转染的方法抑制自噬或Nrf2的表达，MTT法和LDH漏出率法检测NaHS对AN诱导的细胞毒性效应的改变，探索调控自噬或Nrf2/ARE信号通路对NaHS诱导的保护效应的影响。
　　结果：
　　1.采用NaHS(0、200、400、800μM)预处理细胞1 h，与AN单独处理组相比，细胞活力明显升高，LDH渗出率下降。同时，细胞抗氧化物还原性GSH含量升高，氧化应激产物ROS水平降低。
　　2.NaHS单独处理细胞1h后，自噬相关蛋白Beclin1，Atg5表达明显升高，而SQSTM1/P62表达下降，并具有浓度依赖性。同时单独NaHS处理组星形胶质细胞内LC3绿色荧光斑点明显增多，AO染色结果显示酸性自噬泡(红色荧光斑点)也明显增多，采用自噬双标腺病毒检测结果提示自噬流增强，说明 NaHS可诱导星形胶质细胞自噬。
　　3.单纯NaHS处理细胞，与对照组相比，细胞核内Nrf2分布增多，Nrf2/ARE通路下游蛋白HO-1、γ-GCS表达升高，说明外源性NaHS可引起Nrf2发生核转位。
　　4.分别用药理学和基因学手段抑制自噬或Nrf2信号后，NaHS对AN毒性的拮抗效应减弱。
　　结论：
　　1.NaHS预处理对 AN诱导的星形胶质细胞毒性有拮抗效应，并可改善AN诱导的氧化应激损伤。
　　2.单纯NaHS处理可诱导细胞自噬的活化，同时也可诱导Nrf2发生核转位，激活Nrf2/ARE信号通路。
　　3.抑制自噬或Nrf2表达，NaHS对AN毒性的拮抗效应均减弱，说明NaHS对AN毒性的保护效应与其对自噬以及Nrf2/ARE信号通路的激活均有一定的关联。这提示H2S可能成为一种新的丙烯腈中毒治疗药物。

目录

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英文缩写索引

第一章 绪论

1.1 硫化氢

1.2 丙烯腈

1.3 硫化氢与丙烯腈

1.4 硫化氢与自噬

1.5 硫化氢与Nrf2/ARE信号通路

1.6 研究内容

第二章 外源性硫化氢对丙烯腈诱导的原代星形胶质细胞毒性的影响

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 自噬在外源性H2S拮抗AN诱导的细胞毒性中的作用研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 Nrf2信号在外源性H2S拮抗AN诱导的细胞毒性中的作用研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文及参加的学术会议

1. 发表和完成的学术论文

2. 参加的学术会议