绿色木霉产纤维素酶协同作用机制及其应用的研究

摘要

秸秆是一种量大可持续供给的可再生能源物质，秸秆中的纤维素是合成生物质能源的主要原料。纤维素高效糖化生成还原糖，是降低生物乙醇生产成本的前提。纤维素糖化主要包括三种纤维素酶：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，探索三种酶合适的比例关系是提高纤维素糖化能力的关键。 本论文首先优化了绿色木霉AS3.3711液态发酵高产纤维素酶的培养基成分和发酵条件，通过主成分分析和非线性回归分析探索了三种纤维素酶组分发生协同作用的最适合的比例关系，最后探讨了同步糖化、混菌发酵乙醇的规律，本研究为生物乙醇的发酵奠定了理论基础。获得的主要结论如下： （1）利用单因素试验比较了不同碳源、氮源、无机盐和表面活性剂对纤维素酶合成的影响，利用正交设计优化了绿色木霉合成羧甲基纤维素酶（CMC酶）和滤纸酶（FP酶）的最佳培养基组成：产CMC酶最佳培养基配方为（g/L）：果糖0.235、木糖0.5295、玉米浆2.3688、CaCl2 0.061、FeSO4 0.0111、ZnSO4 0.0528，此时最大酶活性为8.268 IU/mL；产FP酶最佳培养基配方为（g/L）：果糖6、玉米浆9.5460、豆粕3.5643、CaCl2 0.3263、FeSO4 0.08、ZnSO4 0.08，此时最大酶活性为4.9242 IU/mL。 （2）通过主成分分析构建了内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶单一和多重相互作用的综合水解能力（CHI）。以Ytrs作为因变量、CHI作为自变量，采用非线性回归分析了CHI与Ytrs之间的关系。结果显示在测试条件下， CHI与Ytrs呈现着正相关。以Ytrs为响应值确定在内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶作为自变量，进行回归分析，探讨了三种酶发生协同作用最为适合的比例关系（13.6:3.8:1），在此条件下，纤维素酶水解秸秆得到的酶解效果最佳，最大糖得率为48.43％。 （3）正交试验确定酿酒酵母与木糖酵母混合菌种发酵产乙醇过程中各影响因素主次顺序依次为发酵周期>初始pH>发酵温度>酵母接种量。采用混合菌种发酵的最佳工艺条件为：酵母接种比为木糖酵母：己糖酵母=1：3，发酵温度32℃，接种量12%，发酵周期144h，初始pH5。在此条件下，乙醇的产率为 10.924 g/L。用最优组分比例的纤维素酶，在此条件下发酵，乙醇产量提高近22%。研究了酒精发酵过程中菌体生长、底物消耗和产物合成的规律，用origin软件对各动力学方程参数进行求解。

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ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 生物能源资源现状

1.2 木质纤维发酵乙醇

1.2.1 预处理

1.2.2 纤维素的糖化

1.2.3 乙醇发酵

1.2.4 乙醇的分离纯化

1.3 纤维素酶

1.3.1 纤维素酶的来源及发酵生产

1.3.2 纤维素酶的作用类型

1.3.3 影响纤维素酶糖化的因素

1）与底物相关的因素

2）与纤维素酶相关的因素

1.3.4 纤维素酶促反应动力学

1.4 乙醇发酵动力学

1.4.1 模型分类

1) 菌体生长动力学

2) 底物消耗动力学

3) 产物生成动力学

1.5 主要研究内容

第二章 绿色木霉液态发酵产纤维素酶的条件优化

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.1.3 仪器设备

2.1.4 培养基

2.1.5 测定方法

粗酶液的制备

纤维素酶活性的测定

1) 葡萄糖标准曲线的绘制

2) 羧甲基纤维素酶（CMCase）活性测定

3) 滤纸酶（FPase）活性测定

2.1.6 实验方案

单因素试验

正交试验设计

验证性试验

2.2 结果与分析

2.2.1 葡萄糖标准曲线

2.2.2 培养基成分对绿色木霉合成纤维素酶的作用

碳源对纤维素酶合成的影响

氮源对产酶的影响

无机盐对产酶的影响

表面活性剂对产酶的影响

2.2.3 正交设计分析

正交试验模型显著性分析

正交试验极差分析

2.5 本章小结

第三章 基于主成分分析三种纤维素酶组分的协同作用

3.1 材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验试剂

3.1.3仪器设备

3.1.4 培养基

3.1.5 粗酶液的制备

3.1.6 米曲霉发酵液催化H2O2氧化降解玉米秸秆木质素预处理

3.1.7 秸秆酶预处理后的糖化能力与基质总还原糖产率关系分析

正交试验设计

纤维素酶水解秸秆

3.1.8 分析测定

羧甲基纤维素酶活测定

滤纸酶活测定

β-葡萄糖苷酶测定

葡萄糖标准曲线的绘制

3.1.9 数据处理

3.2结果与分析

3.2.1 正交试验结果

3.2.2 主成分分析构建CHI

模型显著性测试

因子分析

分析CHI和Ytrs的关系

三种酶的最适比例关系探讨

3.3 本章小结

第四章 同步糖化、木糖和葡萄糖共发酵乙醇研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

菌种

玉米秸秆

4.1.2 实验试剂

4.1.3 仪器设备

4.1.4 培养基

4.1.5 纤维素酶制备

4.1.6 乙醇发酵

4.1.7 实验方案

1) 不同秸秆预处理方法对乙醇产率的影响

2) 温度对乙醇产率的影响

3) 两种酵母接种比例对乙醇产率的影响

正交试验

验证试验

4.1.8 分析测定

菌体浓度测定

葡萄糖含量测定

木糖含量

总糖含量测定

乙醇测定

4.1.9 数据处理

4.2结果与分析

4.2.1 标准曲线

4.2.2 单因素实验

不同预处理方法对酒精发酵的作用

(2) 温度对酒精发酵的作用

(3) 酵母不同比例对酒精发酵的作用

4.2.3 正交试验结果及分析

4.2.4 发酵动力学相关参数

酵母的生长及动力学模型分析

底物消耗及动力学模型分析

产物合成及动力学模型分析

4.2.5 验证性实验结果

4.3 本章小结

第五章 全文总结及展望

5.1 全文主要结论

5.2 创新点

5.3 工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位阶段发表的论文

附录