卡利比克毕赤酵母降解展青霉素的分子机制研究

摘要

展青霉素（Patulin，PAT）是由扩展青霉（Penicillium expansum）等产毒菌产生的，对细菌、植物和动物均具有较强毒性的聚酮类次级代谢产物。P. expansum 侵染贮藏保鲜、加工和货架期的水果及其制品造成腐败，并在侵染过程中大量产生PAT。 由P. expansum引起的青霉病在世界各国普遍存在，对全球水果产业造成了巨大的经济损失，而且由其产生的 PAT 严重威胁消费者的健康。随着生物防治水果采后病害研究的进展，利用拮抗酵母控制并降解水果及其制品中的PAT已经成为学术界研究的热点，并显示出巨大的应用前景。 课题组筛选到一株卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica），前期研究发现P. caribbica可显著抑制苹果上PAT的积累。此外，P. caribbica还能在体外降解PAT。但是，P. caribbica降解PAT的产物、产物毒性、以及P. caribbica降解PAT的分子机制仍然未知。因此，本论文主要研究P. caribbica降解PAT的产物鉴定，降解产物的毒性分析，P. caribbica 在基因表达水平（转录组学）和蛋白表达水平（基于iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification）的蛋白组学技术）对PAT的应答调控机制；PcCRG1基因在P. caribbica降解PAT过程中的作用。 论文的结果如下： 1. P. caribbica降解PAT形成中间产物E-ascladiol和Z-ascladiol，E-ascladiol和Z-ascladiol最终被降解成未知产物。经PAT诱导后的P. caribbica胞内酶对PAT的降解能力显著增强，说明P. caribbica降解PAT的过程是可诱导的，PAT刺激后产生的诱导酶参与PAT的降解过程。 2. 对PAT降解后的中间产物ascladiol和降解终产物的毒性进行了分析，中间产物ascladiol和终产物对大肠杆菌的生长没有抑制作用，而PAT显著抑制了大肠杆菌的生长；中间产物ascladiol和终产物对拟南芥种子的萌发和幼苗生长没有抑制作用，而 PAT 可显著抑制拟南芥种子的萌发和幼苗生长；中间产物ascladiol和终产物对人食管上皮细胞的活性、活性氧（ROS）的积累、细胞增殖和细胞凋亡没有影响，而PAT可显著抑制细胞活性、刺激ROS积累、导致细胞凋亡。结果表明中间产物ascladiol和终产物对大肠杆菌、拟南芥和人食管上皮细胞均没有毒性。 3. 基于蛋白质组学技术分析P. caribbica在蛋白表达水平上对PAT的应答调控机制。结果表明：PAT 刺激引起 119 个蛋白的表达水平下调，51 个蛋白的表达水平上调。下调蛋白主要参与酵母体内物质代谢和生物合成等生物过程。51个上调的蛋白中有22个蛋白为氧化还原酶，此外，超氧化物歧化酶（SOD）、谷氧还蛋白（GRX）和硫氧还蛋白（TRX）等参与抗氧化应激的蛋白表达被激活。说明，P. caribbica通过激活上述蛋白的表达以应对PAT引起的氧化胁迫，维持酵母细胞内的氧化还原平衡。 4. 基于转录组学技术分析P. caribbica在基因表达水平上对PAT的应答调控机制。结果表明：PAT 刺激引起 151 个基因的表达水平显著下调，83 个基因的表达水平显著上调。显著下调基因主要参与蛋白质生物合成，氨基酸代谢和碳水化合物代谢等生物过程。说明PAT对P. caribbica展现出一定的毒性，在一定程度上抑制了酵母的生命活动。显著上调的基因主要参与氧化还原过程，对化学物质、毒素胁迫应答等生物过程，与蛋白质组结果相似。此外，腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因（S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase1，PcCRG1），抗药性转运蛋白基因（Multidrug resistance protein 1，PcMDR1），黄素单加氧酶（Thiol-specific monooxygenase，PcFMOL1）三个与化学物质清除或转化密切相关的基因的表达水平显著上调。 5. 对PcCRG1基因在P. caribbica降解PAT中的作用进行了研究。结果表明：PcCRG1基因敲除突变体酵母对PAT的降解作用显著降低，而PcCRG1过量表达酵母对PAT的降解作用明显增强。外源表达PcCRG1，并纯化得到PcCRG1蛋白。体外生化机制研究发现，PcCRG1 蛋白在底物 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）存在的情况下直接与PAT反应，对其进行降解。

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