微生物转化4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯生产（R）-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的研究

摘要

利用生物催化技术来合成手性化合物，其反应条件温和，选择性强，副反应少，收率相对较高，光学纯度高，环境污染较少，生产成本较低，因此受到越来越多的关注。本文对微生物法不对称催化还原4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯(TFAAE)生成(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯((R)-TFHBE)进行了研究，其成果如下： 从市场上购得的活性干酵母及本实验室保藏的微生物菌株中，经初筛、复筛，获得一株产TFAAE还原酶的菌株葡萄汁酵母SaccharoinycesuvarumSW-58，该菌产酶稳定，所得TFHBE的摩尔转化率较高，立体选择性较好。 对该菌种进行发酵工艺优化，得到了最佳发酵培养基配方：醋酸钠60g/L，玉米浆30g几，KH2PO46g几，MgSO4·7H2O1g几。最佳发酵培养条件为：发酵温度30℃，初始pH值6.0，摇床转速180r/min，发酵周期36h。经过优化，4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯羰基还原酶酶活最高可达319.2U/L，产物(R)-TFHBE的浓度由优化前的3.5g/L提高到4.6g/L，所得产物的光学纯度由优化前的60.8％e.e.提高到优化后的85.0％e.e.。 对菌种还原TFAAE生产(R)-TFHBE工艺进行优化，确定了反应中菌体浓度为40g/L，转化pH值为5.0，转化温度为30℃，以5％葡萄糖为辅助底物时转化效果较好，反应的摩尔转化率随底物浓度增加而下降，底物浓度30g/L时产物浓度达到最高，在反应前添加产物，浓度超过10g/L时产物对菌体的抑制比较明显，转化时间为6h。初步研究了控制e.e.值的方法，发现通过添加抑制剂烯丙基溴，产物的e.e.值有小幅提高，但反应的摩尔转化率却有所下降，而对菌体进行加热处理，对产物的e.e.值没有影响，经过两次重结晶，产物的e.e.值可达到97.3％。 在体系中添加树脂NKA-Ⅱ来解除底物、产物抑制。首先确定了树脂吸附底物、产物的时间和树脂的添加量，考察了底物浓度对添加树脂NKA-Ⅱ微生物转化的影响，同时还考察了树脂对辅助底物葡萄糖的吸附作用。经过耦合工艺优化过后，反应的摩尔转化率比优化前提高了66.9％，产物TFHBE最高浓度达到26.2g/L。 对产品的提取纯化进行了研究，采用溶剂萃取、旋转蒸发和减压蒸馏对产物进行提取和纯化，所得产品纯度为92.4％，收率70.6％，按旋光度方法计算本实验提取样品的光学纯度为81.9％e.e.，经过重结晶并用手性色谱分析，产品纯度为94.5％，对映体过量值达到97.3％e.e.。通过旋光度测定和GC-MS对产物进行定性鉴定，产物样品的气质联用图与标样的十分吻合，判断产品即为(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

第二章产TFAAE羰基还原酶微生物菌种的筛选

第三章产TFAAE羰基还原酶菌种的发酵条件优化

第四章生物催化法还原TFAAE的转化条件研究

第五章微生物法生产TFHBE的反应-分离耦合研究

第六章TFHBE的提取及鉴定

7结论与展望

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章