乳酸菌产生物胺的鉴定及食品中生物胺的检测

摘要

生物胺是微生物经脱羧酶作用产生的碱性低分子有机化合物。适量的生物胺具有一定的生理活性，过量摄入则可能引起健康损害。具有脱羧酶活性的乳酸菌可通过氨基酸的脱羧反应产生具有潜在安全风险的生物胺。
　　 鉴于乳酸菌产生的生物胺对食品安全造成的潜在风险，为了考察本实验室保藏的具有益生功能的乳酸菌的安全性。本文以实验室保藏的61株乳酸菌为待测菌，首先使用鉴别培养基初步筛查产生物胺乳酸菌，再用分子生物学方法进行检测，从基因水平分析其产生物胺的潜在可能性。最后利用反相高效液相色谱法分析氨基酸脱羧酶培养基和食品基质中生物胺的产生情况，为评价益生乳酸菌的安全性提供了方法和依据，以确保其更安全的应用于发酵食品中。研究结果如下：
　　 根据乳酸菌产生物胺的特性，使用氨基酸脱羧酶培养基初步筛查61株乳酸菌产生物胺情况。培养基中添加氨基酸前体(组氨酸，酪氨酸，鸟氨酸，赖氨酸)，经过5’-磷酸吡哆醛诱导，在营养贫瘠的酸性条件下，具有脱羧酶活性的培养基可以产生碱性的生物胺，由指示剂颜色变化显示结果。经此法初步检测到2株乳酸菌有组氨酸脱羧酶活性，16株乳酸菌有酪氨酸脱羧酶活性。61株乳酸菌均没有检测到鸟氨酸，赖氨酸脱羧酶活性。
　　 通过比对已报道的组氨酸脱羧酶和酪氨酸脱羧酶基因序列，利用引物PHDC1/PHDC2和P1-rev/P2-for，以61株乳酸菌基因组DNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)，扩增出3株乳酸菌具有组氨酸脱羧酶基因，22株乳酸菌具有酪氨酸脱羧酶基因。扩增产物测序后进行同源性分析，证明其是目的氨基酸脱羧酶基因片段。此法与微生物检测法的检测结果基本一致，PCR法是一种检测潜在生物胺产生菌的方法，比培养基检测法更加准确可靠。
　　 通过苯甲酰氯柱前衍生反相HPLC色谱法定量分析25株潜在产生生物胺的乳酸菌。四种生物胺的回归方程为：组胺：y=44859x+51524；酪胺；y=52478x+70760；腐胺；y=63114x+65892；尸胺；y=76449x+31781。在1-50mg/L浓度范围内R2均大于0.995，组胺和酪胺的检测限为0.08mg/L，腐胺和尸胺的检测限为0.10mg/L。此法稳定性良好，精密度和回收率高。
　　 HPLC分析了25株生物胺产生乳酸菌在液体脱羧酶培养基和四种发酵食品体系(发酵乳，发酵白菜汁，发酵葡萄汁，发酵肉糜)中产生组胺，酪胺，腐胺，尸胺的情况。结果显示在极端适合乳酸菌产生生物胺的脱羧酶培养中，3株组胺产生菌可产生组胺的量为6.99mg/L-69.46mg/L，22株酪胺产生菌可产生的酪胺的量为4.06mg/L-70.10mg/L。在四种食品体系中，25株乳酸菌在发酵乳中产生的生物胺含量最低，最高不超过4mg/L。在发酵蔬菜，发酵葡萄，发酵肉糜中的酪胺含量均低于20mg/L，组胺含量也均低于6mg/L。这远远低于美国FDA规定的食品中酪胺含量低于100mg/L和组胺含量低于50mg/L的限量标准要求。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

1.1生物胺简介

1.2生物胺的生理功能和毒性

1.3生物胺的检测方法

1.3.1微生物学方法

1.3.2色谱法

1.3.3分子生物学法

1.4组氨酸和酪氨酸脱羧酶基因调控代谢机制

1.5发酵食品中生物胺

1.6立题意义

1.7研究内容

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验菌种

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1菌种的活化

2.2.2液体脱羧酶培养基检测

2.2.3基因组的提取

2.2.4引物设计与选择

2.2.5 PCR法检测氨基酸脱羧酶基因

2.2.6扩增产物的测序及同源性分析

2.2.7色谱条件的选择

2.2.8标准溶液的配制

2.2.9衍生化处理

2.2.10样品的制备

2.2.11检测限，回收率，精密度试验

3 结果与讨论

3.1微生物学法检测乳酸菌的氨基酸脱羧酶活性

3.1.1液体氨基酸脱羧酶培养基成分选择

3.1.2 61株乳酸菌氨基酸脱羧酶活性的初步检测

3.2分子生物学法检测潜在生物胺产生乳酸菌

3.2.1基因组的提取

3.2.2 PCR引物的设计及选择

3.2.3组氨酸脱羧酶和酪氨酸脱羧酶基因的PCR扩增

3.2.4组氨酸脱羧酶和酪氨酸脱羧酶基因序列比对及分析

3.2.5 PCR法与培养基检测法的比较

3.3 RT-HPLC检测生物胺的方法研究

3.3.1色谱条件的选择

3.3.2标准曲线的绘制

3.3.3回收率及精密度试验

3.3.4乳酸菌产生物胺的HPLC检测

3.4乳酸菌在不同食品体系中产生物胺情况分析

主要结论

致谢

参考文献

附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文

附表