外周血干细胞采集物经长期液氮保存后活性和免疫学特性的变化

摘要

目的:①比较长期液氮深低温冷冻保存的外周血造血干细胞(PBSC)采集物与新鲜采集物中有核细胞(NC)的活性、CFU-GM生成能力的差异，探讨影响CFU-GM形成的相关因素；②比较长期液氮深低温冷冻保存的外周血造血干细胞采集物与新鲜采集物中淋巴细胞的免疫表型及其分泌细胞因子能力的差异；③观察外周血干细胞采集物中有核细胞经长期深低温冷冻保存后形成CIK细胞能力及其细胞毒活性。 方法:外周血干细胞采集物标本共47例，冷冻标本按保存时间分为两组：实验1组(保存3～5年，26例)，实验2组(保存5～7年，9例)；新鲜采集的标本(12例)作为对照组。冷冻标本经解冻、新鲜标本经裂解红细胞后行CFU-GM培养，流式细胞学检测有核细胞中核酸染料7AAD着色的细胞百分比(代表坏死率)以及有核细胞中表达活化的caspase-3的细胞百分比(代表凋亡率)。流式细胞学检测CD34+细胞百分比及淋巴细胞免疫表型。5×10<'5>/ml的有核细胞悬液用10μg/ml PHA刺激分泌细胞因子，培养48h后收集培养液上清。EIlSA法检测培养液上清中的细胞因子：IL-2、IFN-γ和TNF-α。利用10例冷冻标本和7例新鲜标本经IFN-γ、抗CD3McAb、IL-2联合诱导扩增CIK细胞，14天后收获细胞，检测活力、免疫表型，MTT法检测CIK细胞对K562、Raji细胞株的杀伤活性。 结果:两实验组的坏死率和凋亡率均高于对照组(P<0.05)，实验2组凋亡率为35.60﹪±17.51﹪，高于实验1组(24.14﹪+16.87﹪，P=0.031)。CFU-GM/10<'5>NC随保存时间延长有下降趋势，CFU-GM/10<'5>NC与CD34+细胞的百分比有显著相关性(P<0.05)，与有核细胞活性无相关性。三组的淋巴细胞免疫表型及其分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α无统计学差异。冷冻标本和新鲜标本来源的CIK细胞分别扩增了41.8倍(11.50～80.64倍)和22.8倍(11.84～35.50倍)，活化后CD8+T细胞比例升高(P<0.05)，但CD3+CDl6/56+细胞比例并没有升高。两种来源的CIK细胞对K562、RaiJi细胞株的杀伤作用无显著性差异。 结论:与新鲜的外周血干细胞采集物相比，冷冻保存3～7年的采集物中有核细胞活性减低，体外形成CFU-GM的能力下降；但淋巴细胞的免疫表型和分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的能力无明显差异。冷冻PBSC采集物中的有核细胞体外形成CFU-GM的能力下降可能与CD34+细胞的活性丢失有关。利用长期冷冻保存的外周血干细胞采集物可以大量扩增出CIK细胞，具有与新鲜标本来源的CIK细胞相同的细胞毒活性。

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文摘

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前言

文献综述

综述一 外周血造血干细胞体外保存的研究进展

综述二 CIK细胞的研究进展

实验

实验一 PBSC采集物经长期液氮冻存后活性、淋巴细胞表型及其分泌细胞因子功能的变化

第一章 材料和方法

第二章 结果

第三章 讨论

第四章 结论

实验二 长期液氮冻存的PBSC采集物形成CIK细胞的能力及其生物学活性的研究

第一章 材料和方法

第二章 结果

第三章　讨论

第四章 结论

致谢

参考文献

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