壳聚糖修饰氧化铁磁性纳米颗粒及应用于细胞选择摄取研究

摘要

氧化铁磁性纳米颗粒在磁共振成像对比度增强、组织修复、免疫测定、高热疗法、药物释放和细胞分选等方面有着广阔的应用前景。根据不同的应用需求，合理构建磁性纳米材料的物理化学性质，深入研究其生物学效应，尤其在细胞层面有更深入的认识和操控能力是当前研究的热点之一。磁性纳米颗粒在活细胞成像技术己显示出巨大的潜力，合理的表面改性、纳米化学和连接相关的生物分子能够有效克服当前细胞成像的一些局限性，例如迅速有效的摄取纳米粒子、有效放大成像信号和提高成像质量等。影响细胞成像技术的主要因素包括纳米粒子浓度、电荷、尺寸、表面性质和聚集态等，更好地了解纳米粒子对细胞的影响、细胞摄取的机制将对纳米粒子细胞成像技术的发展将产生深远的影响。
　　 本文选用天然高分子多糖壳聚糖作为修饰材料，它是一种在自然界广泛存在、具有氨基和羟基基团的天然高分子多糖，具有无毒，无抗原性，生物相容性好、生物可降解性、促进细胞吸收等优点。用它修饰氧化铁磁性纳米颗粒(γ-Fe2O3，MNPs)表面，得到适合生物医学应用的样品；合成能够高效标记癌细胞的荧光衍生壳聚糖磁性纳米探针；研究不同表面性质、聚集态的磁性纳米颗粒对癌细胞的作用；探讨壳聚糖磁性纳米颗粒摄入癌细胞的动力学过程;构建在生理环境下相对稳定、高免疫活性、体内外特异性靶向卵巢癌细胞的分子影像探针抗精子蛋白17-磁性纳米颗粒。本研究主要工作包括以下几方面：
　　 ⑴通过共沉淀法制备氧化铁磁性纳米颗粒，用壳聚糖对其表面进行修饰得到样品(CS@MNPs)；表征其形貌结构、尺寸、表面基团、表面电荷、磁学性质和在不同介质中的稳定性等。实验结果表明，CS@MNPs具有典型的立方反尖晶石晶体结构；粒径为16.5nm；在生理条件下(pH值7.4)拥有较高的正电荷(10mV)；呈现超顺磁性，对驰豫时间T1、T2，尤其是T2*具有很强的响应；在双蒸馏水和含10％新生牛血清的RPMI1640培养液中具有良好的稳定性，满足下一步生物医学应用的要求。
　　 ⑵构建同时具有荧光和磁性的纳米结构有利于在体的疾病诊断，实现实时在线示踪活细胞。通过FITC的异硫氰酸根与壳聚糖的氨基结合得到具有荧光性质的改性壳聚糖(FITC-CS)，修饰磁性纳米颗粒，得到一种简单、稳定的双功能纳米探针，它同时具有荧光和磁学性质。与人肝癌细胞SMMC-7721共孵育，通过流式细胞术、磁共振成像、荧光显微镜等手段证明这种FITC-CS磁性纳米探针能够高效的标记癌细胞。在细胞数量为1×104时，T2*信号强度明显降低。细胞活性试验证明这种探针有良好的生物相容性，符合生物医学应用的要求。
　　 ⑶研究了不同表面以及不同聚集状态的磁性纳米颗粒对人肝癌细胞SMMC-7721和人鼻咽癌细胞KB摄入量的影响。制备了三种样品：二巯基丁二酸修饰的磁性纳米颗粒(DMSA@MNPs，17.3nm，带负电)，壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒(CS@MNPs，16.5nm，带正电)，以及壳聚糖与DMSA@MNPs通过静电吸附作用形成磁性聚集体(CS-DMSA@MNps，85.7nm，带正电)。研究了三种材料与SMMC-7721和KB细胞共孵育后的摄入情况；考察了不同的作用包括细胞形态、细胞的存活、以及细胞摄入铁的量、磁共振成像T2*信号强弱等。结果表明，影响癌细胞摄取的因素包括材料的表面性质、聚集状态、孵育时间、初始浓度等。三种纳米材料都可以进入细胞，CS-DMSA@MNPs摄入量大于CS@MNPs，DMSA@MNPs最少。说明表面带正电荷的磁性纳米颗粒比带负电荷的更容易进入细胞；癌细胞摄取聚集体状态MNPs的能力更强，而且一定程度的聚集能够缩短横向驰豫时间，有利于增强对比度；壳聚糖修饰磁性材料后可以明显提高癌细胞的摄入量，说明壳聚糖具有较强的吸收促进作用，能够有效增加细胞摄取。
　　 ⑷采用磁共振T2*信号强度作为细胞摄取磁性纳米颗粒的指标，初步探讨了在不同孵育温度(4℃，37℃)下磁性纳米颗粒CS@MNPs摄入人肝癌细胞SMMC-7721的动力学过程。实验证明癌细胞对纳米颗粒的内吞是一个依赖于培育温度、颗粒的浓度和共孵育时间的耗能过程，并在胞内的积累量逐渐达到饱和，有利于磁共振成像信号的放大。磁性纳米颗粒摄入癌细胞摄取可以分为两个过程，先是吸附在细胞膜表面，随后再通过内吞或者胞饮的方式进入细胞器。通过抑制剂预处理细胞的实验结果可知，Clathrin蛋白抑制剂对细胞的内吞能力有较强的抑制;线粒体呼吸链抑制剂对细胞的摄取有一定影响;微管蛋白抑制剂和细胞膜穴样凹陷抑制剂对细胞的抑制作用较弱。人肝癌细胞SMMC-7721对CS@MNPs的摄取主要是在网格蛋白的介导下，通过液相内吞和吸附内吞的共同作用完成的。
　　 ⑸利用精子蛋白17构建了一种新型的免疫磁性纳米探针Anti-Sp17-MNPs，可作为特异性靶向卵巢癌的磁共振分子影像探针。在偶联剂作用下，将壳聚糖修饰磁性氧化铁纳米颗粒与抗人Sp17抗体结合，得到免疫磁性纳米探针(Anti-Sp17-MNPs)。通过透射电镜、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质分析、铁含量测定、酶联免疫吸附试验等手段，评价了免疫磁性纳米探针的制备效果。结果表明此探针具有在生理环境下相对稳定、高免疫活性等优点。体外磁共振成像研究表明Anti-Sp17-MNPs对于转染人Sp17的卵巢癌细胞HO-8910细胞具有较高的靶向性，无明显的非特异吸附。体内磁共振成像研究表明Anti-Sp17-MNPs能够随血液循环靶向到达肿瘤部位。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：专用术语注释表

声明

第一章绪论

1.1磁性纳米材料的生物医学应用

1.1.1磁分离和纯化

1.1.2磁转染

1.1.3磁共振造影剂

1.1.4肿瘤热疗

1.1.5药物载体

1.1.6组织修复

1.2磁性纳米材料的制备和修饰

1.2.1磁性纳米材料的制备

1.2.2应用于生物医学的磁性纳米粒子的表面修饰

1.3磁性纳米材料的性质与生物学效应

1.3.1纳米颗粒的尺寸对细胞摄取的影响

1.3.2纳米颗粒的聚集态对细胞摄取的影响

1.3.3纳米颗粒的表面性质对细胞摄取的影响

1.3.4目标配体的表面功能化对细胞摄取的影响

1.4论文的选题背景和研究内容

第二章壳聚糖磁性氧化铁纳米颗粒修饰研究

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1主要实验材料及仪器

2.2.2磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法与步骤

2.2.3壳聚糖对磁性氧化铁纳米颗粒的修饰方法与步骤

2.2.4磁流体铁浓度的测定

2.2.5磁流体性质表征

2.2.6磁性纳米颗粒在不同介质中稳定性测定

2.3结果与讨论

2.3.1壳聚糖磁性纳米颗粒的制备和表征

2.3.2壳聚糖磁性纳米颗粒的表面性质

2.3.3壳聚糖磁性纳米颗粒的磁学性质

2.3.4壳聚糖磁性纳米颗粒的磁共振成像测定

2.3.5壳聚糖磁性纳米颗粒在不同分散介质的稳定性

2.4本章小结

第三章荧光衍生壳聚糖磁性纳米颗粒的制备及细胞成像研究

3.1引言

3.2试验部分

3.2.1主要实验材料及仪器

3.2.2荧光衍生壳聚糖磁性纳米颗粒的制备和表征

3.2.3细胞培养

3.2.4细胞摄取实验

3.2.5细胞活力检测

3.3结果与讨论

3.3.1荧光衍生壳聚糖磁性纳米颗粒的表征

3.3.2癌细胞摄取定量分析结果

3.3.3癌细胞摄取定性分析结果

3.3.4体外细胞活性研究

3.4本章小结

第四章磁性纳米颗粒的表面电荷、聚集态对癌细胞摄取的影响研究

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1主要试验材料及仪器

4.2.2三种磁性纳米颗粒的制备和表征

4.2.3细胞培养

4.2.4细胞摄取实验

4.2.5细胞活力检测

4.2.6细胞凋亡检测

4.3结果与讨论

4.3.1三种磁性纳米材料的性质表征

4.3.2细胞摄取结果

4.3.3体外细胞活性和细胞凋亡研究

4.4本章小结

第五章壳聚糖磁性纳米颗粒摄入癌细胞的动力学研究

5.1引言

5.2试验部分

5.2.1主要实验材料及仪器

5.2.2癌细胞摄取壳聚糖磁性纳米颗粒的实验方法与步骤

5.3结果与讨论

5.3.1癌细胞对壳聚糖磁性纳米颗粒的摄取动力学研究

5.3.2细胞切片透射电镜结果

5.3.3不同抑制剂对癌细胞摄取壳聚糖磁性纳米颗粒的影响研究

5.4小结

第六章抗精子蛋白17-免疫磁性纳米探针的设计及体内外磁共振成像研究

6.1引言

6.2实验部分

6.2.1主要实验材料及仪器

6.2.2免疫磁性纳米探针的制备

6.2.3抗精子蛋白17-磁性纳米探针的表征

6.2.4细胞培养

6.2.5细胞活性检测

6.2.6体外磁共振检测免疫磁性纳米颗粒的特异性

6.2.7体内磁共振成像实验

6.2.8肿瘤组织化学分析

6.3结果与讨论

6.3.1 Anti-Sp17免疫磁性纳米探针的设计和表征

6.3.2体外细胞活性研究

6.3.3体外磁共振检测免疫磁性颗粒的特异性

6.3.4体内磁共振成像靶向肿瘤试验结果

6.3.5肿瘤组织化学分析结果

6.4本章小结

第七章总结与展望

7.1全文总结

7.2工作展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致 谢