高通量测序文库制备及其在孕妇血游离microRNA表达分析中的应用

摘要

随着对人类基因组认识的不断加深以及低成本、高通量测序技术的发展，个体化医疗已经成为现代医学的重要发展方向之一。目前，第二代测序技术已经发展成为最成熟、应用最广泛的测序技术。循环核酸（游离核酸）是指以游离形式存在于生物体液循环内的胞外核酸，越来越多的研究发现生物体游离核酸与疾病之间存在紧密的联系，孕妇血浆中游离胎儿microRNA(miRNA)及其来源和清除机制的研究一直是研究的热点。孕妇血浆中胎儿游离核酸的研究表明，游离核酸表达谱可作为无创性产前诊断的依据。生物芯片和新一代DNA测序等高通量、高灵敏度检测技术的发展将为循环microRNA临床应用奠定基础，特别是新一代高通量测序平台为发现以及定量分析miRNA提供了有力的工具。其中，SOLID测序平台测序读长相对较短，特别适合于miRNA的检测和分析。
　　 本文对SOLiD测序平台的文库制备方法以及试剂盒进行了优化。在此基础上，应用优化的文库制备方法对孕妇外周血游离miRNA的表达谱进行了检测。本文的主要工作如下:
　　 一、SOLID高通量测序文库制备方法的研究
　　 本文对现有的用于SOLID高通量测序平台的miRNA文库制备方法进行了改进和优化，用一对单链RNA接头替换原有的双链接头。该优化反应中将两个两端修饰的接头分两次加入反应体系，使得接头每次只能在3'端或5'端与目标序列连接，每次连接后采用凝胶电泳对文库进行纯化。研究表明，改进的制备方案有效地缓解了原有双链接头自连接现象。
　　 本文还提出一种可进行单分子核酸扩增的磁珠载体，并将其应用于核酸测序文库的制备中。文中探索了磁珠表面的修饰和固相载体对引物连接和核酸扩增的影响，在磁珠表面进行待测序的核酸序列的连接和扩增，扩增后的磁珠表面包含单拷贝的待测核酸序列，可应用于多种高通量测序技术的文库制备。
　　 二、SOLiD测序技术在研究孕妇血浆miRNA中的应用
　　 本文利用改进的文库制备方法对孕妇外周血中的游离miRNA进行测序分析，优化的文库制备方案和试剂盒，维持了较高的保真度，制备出理想的miRNA测序文库。本文挑选了孕妇血浆中的特异性miRNA，测序结果分析显示孕妇外周血游离miRNA在产后呈现显著的表达下调现象。本文应用荧光定量RT-PCR技术进行验证，用CT值分析算法对RT-PCR的实验结果数据进行分析，结果与测序一致，证明了高通量测序技术在miRNA表达分析中的准确性和可靠性。此外，本文还分析了正常孕妇和子痫患者产前产后miRNA表达差异。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 游离核酸的研究进展

1．1．1 游离核酸的发现和发展

1．1．2 游离核酸的应用

1．2 胎儿核酸

1．2．1 胎儿核酸的研究进展

1．2．2 胎儿游离核酸的应用

1．3 胎儿游离核酸的来源和清除机制

1．3．1 胎儿游离核酸的来源

1．3．2 胎儿游离核酸的存在形式与动力学性质

1．3．3 胎儿游离核酸的清除机制

1．4 microRNA的研究进展

1．4．1 microRNA的发现和功能

1．4．2 microRNA的生物学特性

1．4．3 microRNA的形成与作用机制

1．4．4 microRNA的检测技术

1．5 新一代高通量测序的研究进展

1．5．1 454测序技术

1．5．2 Solexa测序技术

1．5．3 SOLiD测序技术

1．6 论文的研究目的与研究内容

第二章 高通量测序技术样本制备方法的研究

2．1 引言

2．2 高通量测序文库制备方法研究

2．2．1 实验材料

2．2．2 SOLiD高通量测序microRNA文库制备实验方法

2．2．3 SOLiD高通量测序模板制备实验方法

2．2．4 实验结果与讨论

2．3 本章小节

第三章 高通量测序在研究孕妇血浆游离microRNA表达分析中的应用

3．1 引言

3．2 孕妇血浆microRNA的SOLiD测序研究

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 荧光定量PCR验证

3．3．1 荧光定量PCR设计

3．3．2 荧光定量PCR实验

3．4 实验结果分析与讨论

3．4．1 microRNA质量控制

3．4．2 microRNA文库半定量实验

3．4．3 血浆microRNA测序结果

3．5 本章小结

第四章 总结与展望

4．1 研究总结

4．1．1 血浆microRNA测序文库制备研究

4．1．2 文库制备新方法——双固体界面扩增定量模型研究

4．1．3 孕妇血浆microRNA测序及验证平台的建立

4．2 展望

参考文献

附录

致谢