功能化磁性纳米Fe3O4颗粒共聚合5溴汉防已甲素和柔红霉素在逆转恶性血液病多药耐药中的体外及体内研究

摘要

目的：本实验旨在研究功能化的磁性纳米四氧化三铁(magneticnanoparticleFe3O4，Fe3O4-MNPs)、5溴汉防己甲素(5-bromotetrandrine，BrTet)与柔红霉素(daunomycin，DNR)聚合的磁性纳米微球的生物相容性和安全性，探讨其对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用及可能机理，及其在热疗中的作用，并初步分析其体内分布特性，为磁性纳米微球作为耐药逆转剂的临床应用提供理论依据。
　　方法：1、MTT和流式细胞仪(flowcytometry，FCM)检测复合磁性纳米微球对人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的细胞毒作用；2、采用溶血实验评价其有无溶血作用；3、小鼠腹腔注射Fe3O4-MNPs聚合DNR的纳米微球生理盐水悬浮液以测定其半数致死量(medianlethaldose，LD50)；4、微核试验评价其对骨髓细胞有无致畸、致突变等遗传毒性作用：急性毒性实验评价其对小鼠一般情况以及肝肾功能的影响；5、Fe3O4-MNPs(10μg/ml)、BrTet(0.5μM)单独以及联合作用于K562细胞、K562/A02细胞48小时后，MTT法检测DNR对细胞的半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50)、FCM检测细胞内DNR浓度、相对定量逆转录聚合酶链反应(relativequantificationreversetranscriptionpolymerasechainreaction，RQRT-PCR)检测多药耐药蛋白1(multidrugresistanceprotein1，MDR1)和多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein，MRP)mRNA水平改变、免疫印迹(Westernblot，WB)检测P-糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)，MRP等耐药相关蛋白水平改变、比色法检测细胞内还原型谷胱甘肽(reducedglutathione，rGSH)；6、建立粒细胞肉瘤多药耐药的动物模型：将具有典型MDR表型的K562/A02以及其亲本K562细胞分别接种于BALB/C裸鼠背侧皮下，接种细胞数为1×107细胞/0.2ml/只，免疫组化检测移植瘤耐药性。当肿瘤大小达1000mm3时，将其随机分为4组：(每组包括耐药荷瘤鼠和敏感荷瘤鼠各半)A组，对照组，即生理盐水组；B组，游离DNR组；C组，游离Fe3O4-MNPs纳米粒组；D组，Fe3O4-MNPs聚合DNR的纳米载药微球组。各组经肿瘤局部多点注射药物(按1mg/kgDNR计算，总给药体积为1/2肿瘤体积)，各组置交变磁场中作用40分钟，期间监测肿瘤中心区、肿瘤边缘区以及正常皮肤温度变化；观察治疗后12天的肿瘤体积变化、肿瘤及心、肝、肺、脾、肾等主要脏器病理改变；7、检测Fe3O4-MNPs共聚合BrTet及DNR的纳米载药微球在大鼠体内分布，7.0T核磁共振(magneticresonanceimaging，MRI)检测Fe3O4-MNPs在肝脾随进入大鼠体内时间变化的分布改变，高效液相色谱-荧光法(highperformanceliquidchromatographywithfluorescence，HPLC-Fl)和紫外分光光度法分别检测DNR和BrTet在血浆和主要脏器的浓度。
　　结果：1、2.5-10μg/mlFe3O4-MNPs和0.25-2μMBrTet浓度范围内，对PBMCs细胞的毒性作用分级为0-1级，无明显细胞毒作用，而20μg/mlFe3O4-MNPs干预PBMCs细胞24小时后，其细胞毒作用需结合形态学分析；与单用DNR组相比，磁性纳米Fe3O4-DNR微球单用或联合0.5μMBrTet处理PBMCs细胞24小时后细胞内DNR浓度无明显差别；2、溶血试验中磁性纳米Fe3O4-DNR微球溶血率为2.908％，小于5％；3、昆明小鼠腹腔注射该材料混悬液，其LD50为1009.71mg/kg体重(其中相对DNR含量为10mg/kg体重)，其95％的可信区间为769.11-1262.40mg/kg体重(其中相对DNR含量为7.69-12.62mg/kg体重)，与单用DNR组LD50相比无显著差异(单用DNR组LD50为8.51mg/kg体重，其95％的可信区间为6.48-10.37mg/kg体重)；4、微核试验结果表明该材料对昆明小鼠骨髓微核形成率为0.02％，与阴性对照组相比无显著差异(P>0.05)，而与阳性对照环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)组相比有显著差异(P<0.05)；5、急性毒性实验结果显示对照组、腹腔注射磁性纳米Fe3O4-DNR微球组以及等剂量DNR组各小鼠在24、48、72小时3个时间段内体质量无显著性差异(P>0.05)；小鼠活动、进食、排泄正常，未见步态不稳、惊厥、瘫痪及呼吸抑制等毒性反应；腹腔注射磁性纳米Fe3O4-DNR微球组小鼠谷丙转氨酶(alaninetransarninase，ALT)、尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)和肌酐清除率(creatinineclearancerate，CCr)分别为66.0±28.55U/l，9.06±1.05mmol/l，18.03±1.84μmol/l，无肝肾功能损害，且与对照组及等剂量DNR组相比无显著差异(P>0.05)；6、Fe3O4-MNPs和BrTet处理前后DNR对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用：
　　(1)K562细胞、K562/A02细胞IC50值分别为1.504±0.204μg/ml和20.081±2.876μg/ml，K562/A02细胞对DNR的耐药倍数为K562细胞的13.35倍；(2)Fe3O4-MNPs(10μg/ml)、BrTet(0.5μM)单独以及联合作用48小时后对K562细胞的IC50无明显影响；(3)Fe3O4-MNPs(10μg/ml)、BrTet(0.5μM)单独作用48小时后对K562/A02细胞IC50分别为：7.167±0.569μg/ml、3.085±0.432μg/ml，逆转倍数(foldofreversal，FR)分别为：2.80倍、6.51倍。三者联合其IC50减低为1.232±0.172μg/ml，FR为16.30倍，差异有统计学意义；7、FCM检测细胞内DNR浓度：(1)K562/A02细胞内DNR平均荧光强度为2422±336.32，为K562细胞的23.41％(K562细胞内DNR平均荧光强度为10347±465.09)；(2)K562/A02细胞经Fe3O4-MNPs(10μg/ml)、BrTet(0.5μM)单独以及联合作用48小时，细胞内DNR平均荧光强度分别为3948±579.54，4577±479.14和5576±694.81，分别为K562细胞的38.16％、44.24％和53.89％，BrTet处理组及两药联合的处理组细胞内DNR浓度明显增加，与K562/A02细胞对照组比较有显著性差异(P<0.05)；8、RQRT-PCR和WB检测耐药相关蛋白表达：Fe3O4-DNR协同BrTet能明显抑制K562/A02细胞P-gp和MRP蛋白mRNA和蛋白水平的表达；9、细胞内rGSH检测：K562细胞内rGSH浓度为13.760±0.677μM，K562/A02细胞内内rGSH浓度为28.068±1.805μM，是K562敏感细胞的2.04倍；单用DNR处理K562细胞和K562/A02细胞48小时，细胞内rGSH浓度与空白对照组相比无明显升高或者减低(P>0.05)；K562/A02细胞经Fe3O4-MNPs(10μg/ml)、BrTet(0.5μM)单独以及联合作用48小时，细胞内rGSH浓度分别为6.096±0.283μM、8.213±0.591μM和2.843±2.157μM，与对照组和单用DNR组比有显著差异(P<0.05)；10、K562敏感肿瘤细胞以及K562/A02耐药肿瘤细胞成瘤率均为100％，且免疫组化显示K562/A02移植瘤P-gp表达阳性，保留原有耐药特性。对于K562移植瘤，C、D组癌中心区和边缘区温度升至42℃以上，显著高于正常癌旁组织(P<0.001)；A、B组各部位的温度无明显升高。治疗后12天，C、D组肿瘤体积明显缩小，组织学检查可见肿瘤细胞大面积坏死，普鲁士蓝染色可见肿瘤灶及肿瘤边缘铁微粒沉积，但是两组的肿瘤生长抑制率无明显变化(P>0.05)；A、B组肿瘤体积增大，肿瘤生长率显著增加，肿瘤组织呈轻度坏死。对于K562/A02移植瘤，C、D组癌中心区和边缘区温度亦显著高于正常皮肤(P<0.001)；A、B组各部位的温度无明显升高。治疗后12天，C、D组肿瘤体积明显缩小，组织学检查可见肿瘤细胞大面积坏死，且C组肿瘤生长抑制率明显高于D组(P<0.05)；A、B组肿瘤体积增大，肿瘤生长率显著增加，肿瘤组织呈轻度坏死。各实验组心、肝、肾、脾、肺等脏器无明显病理改变；11、Fe3O4-MNPs共聚合DNR及BrTet组经大鼠尾静脉注射纳米微球后，给药后2小时内肝脏和脾脏内的DNR和BrTet浓度明显高于单用DNR或者BrTet组，并能维持较高水平的组织药物浓度和血药浓度至给药后24小时，同时延缓药物经肾脏清除时间。
　　结论：Fe3O4-MNPs共聚合DNR和BrTet的磁性复合纳米微球在体内以及体外实验对无明显细胞毒作用，具有较广的安全值范围，无溶血作用，无遗传毒性和急性全身毒性，具有良好的生物相容性和安全性，可作为同类化疗药物替代材料用于相关急性的临床治疗；有效逆转浓度的Fe3O4-MNPs和BrTet单独以及联合应用均可逆转耐药，且两药联合逆转作用最强，其逆转机制与抑制P-gp、MRP等耐药相关蛋白的表达、增加细胞内DNR浓度、抑制细胞内rGSH的合成有关；以K562/A02细胞建立的裸小鼠粒细胞肉瘤耐药移植瘤模型，仍保持体外的耐药活性。在交变磁场下，肿瘤组织升温至42℃以上，Fe3O4-MNPs共聚合BrTet及DNR的纳米载药微球对耐药肿瘤组织有独特的靶向作用，表现为明显的热化疗协同增效的治疗作用，并且在肿瘤磁流体热疗方面具有良好的应用前景；Fe3O4-MNPs共聚合BrTet及DNR在大鼠体内能改变DNR和BrTet的分布特性，维持较高的血药以及组织药物浓度和循环时间。