MyoD基因局部转染心肌成纤维细胞用于心肌重建的实验研究

摘要

第一部分MyoD基因重组腺病毒载体的构建 目的：构建MyoD基因重组腺病毒载体，为研究MyoD基因对心肌损伤的修复作用提供实验基础。 方法：从pEMSV-MyoD质粒上用PCR方法扩增出MyoDcDNA片段，并使MyoD基因加上CACC序列接头，经过定向拓扑克隆使目的基因连接到转移载体上，测序验证后用LR酶促反应将目的基因转移到腺病毒表达载体DNA上，获得MyoD基因重组的腺病毒DNA，转染HEK293A细胞，包装、扩增MyoD基因重组的腺病毒，测定病毒滴度，并对此病毒进行PCR鉴定。 结果：经PCR鉴定和DNA测序证实MyoD基因重组腺病毒含大小正确的目的片段，其DNA序列正确。病毒滴度为1.3-4.8×1011pfu/ml。 结论：成功构建了MyoD基因重组腺病毒载体。 第二部分MyoD基因诱导体外培养大鼠心肌成纤维细胞向骨骼肌成肌细胞分化的实验研究 第一节大鼠心室成纤维细胞的分离、培养 目的：探讨大鼠心室成纤维细胞分离、培养的方法。 方法：无菌条件下剪取SD大鼠乳鼠心室肌，采用胰酶消化的方法获取心室肌细胞，差速贴壁法分离心室成纤维细胞，进行体外培养、扩增，观察所培养细胞的形态，并用免疫细胞化学方法检测波形蛋白、纤维连接蛋白和平滑肌肌动蛋白的表达。 结果：心室成纤维细胞在体外生长、增殖良好，生长迅速。刚分离出的心室成纤维细胞呈类圆形、三角形或多角形；24h-48h细胞体积增大，呈三角形、梭形或多角形；72h即呈融合状态；消化传代后细胞生长速度加快，30min后开始贴壁，12h后贴壁完全，约2-3天即可传代一次。免疫细胞化学检测培养的心室成纤维细胞波形蛋白、纤维连接蛋白表达均为阳性，平滑肌肌动蛋白表达阴性。 结论：胰酶消化、差速贴壁法是一种合适的心室成纤维细胞的培养方法。 第二节MyoD基因诱导体外培养大鼠心肌成纤维细胞向骨骼肌成肌细胞分化 目的：探讨MyoD基因诱导体外培养的大鼠心肌成纤维细胞向成肌细胞分化的可能性。 方法：SD大鼠乳鼠10只，采用胰酶消化、差速贴壁法分离、培养心室成纤维细胞，将培养的第3代心室成纤维细胞分为3组：对照组、LacZ基因组、MyoD基因组。将MyoD基因和LacZ基因重组腺病毒原液以2000pfu/cell的浓度分别转染前1天接种的成纤维细胞，转染时换无血清培养基，3h后洗去病毒，换完全培养基，40h后换成含2﹪胎牛血清的分化培养基继续培养5天。相差显微镜及透射电镜观察对照组和诱导组细胞的形态；RT-PCR和Westernblot方法检测MyoD和肌细胞生成素(myogenin)的表达；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白重链和结蛋白(desmin)的表达。 结果：对照组心肌成纤维细胞呈梭形、多角形、不规则形，胞体较大，细胞浆透明，粗面内质网丰富，未见肌丝结构；转染MyoD基因重组腺病毒后，大鼠心肌成纤维细胞胞体伸展，逐渐变长，排列渐趋一致，7天后可见长梭形细胞平行排列走向，部分细胞融合形成肌管，胞浆内可见肌丝束；转染LacZ基因重组腺病毒的细胞转染前后形态无变化，与对照组比较细胞形态无差别。RT-PCR可检测出转染MyoD基因后细胞表达MyoDmRNA；Westernblot结果表明转染后细胞表达MyoD和myogenin；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白重链和desmin表达均为阳性。 结论：MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心肌成纤维细胞向骨骼肌成肌细胞分化，为进一步研究MyoD基因对心肌损伤的修复作用奠定了基础。 第三部分MyoD基因局部转染心肌成纤维细胞治疗心肌梗死的实验研究第一节大鼠急性心肌梗死模型的建立 目的：探讨建立大鼠急性心肌梗死模型的方法。 方法：30只SD大鼠随机分为手术组和假手术组，每组各15只，麻醉后经鼻腔插管连接动物呼吸机，切开胸廓暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，假手术组只穿线不结扎，手术中观察心电图的变化，4周后行心脏二维超声心动图检查，并取心脏标本行病理检查。 结果：手术组结扎冠状动脉后，可见左室前壁逐渐由鲜红转变为暗紫色室壁膨出；术后心电图提示ST段明显抬高，呈一单向曲线；术后4周超声检查发现左心室前壁局部运动异常伴有室壁瘤形成；心脏大体标本可见左室前壁大面积灰白色心肌梗死区，局部心肌变薄，室壁塌陷形成室壁瘤。光镜检查提示假手术组心肌纤维规则排列，手术组梗死区心肌细胞胞浆凝固性坏死，纤维结缔组织增生。 结论：开胸结扎冠状动脉前降支是建立大鼠急性心肌梗死模型切实可行的方法。 第二节局部注射MyoD基因重组腺病毒修复心肌梗死后心肌损伤的实验研究 目的：研究MyoD基因重组腺病毒局部注入梗死区组织后对心肌损伤的修复作用。 方法：45只心肌梗死大鼠随机分为MyoD基因组、LacZ基因组和对照组，每组15只，梗死1周后MyoD基因组在心肌梗死区注入100ul内含2×1010pfuMyoD基因重组腺病毒的无血清DMEM，LacZ基因组注入同样剂量LacZ基因重组腺病毒，对照组予以等量无血清DMEM培养液接种，注射部位用黑丝线标记。干预治疗后4周处死动物，获取心脏标本，RT-PCR检测梗死区组织MyoDmRNA的表达；送光镜及电镜检查；免疫组化测定梗死区组织骨骼肌肌球蛋白重链和cTnI的表达；切片后1﹪TTC染色，测定梗死厚度、梗死面积，并计算其占左心室面积的百分比。 结果：MyoD基因转染后在心肌梗死部位用RT-PCR方法检测到MyoDmRNA的表达，而LacZ基因组和对照组无MyoDmRNA的表达；HE染色光镜检查显示LacZ基因组和对照组梗死区镜下见纤维结缔组织增生，梗死区内无肌肉组织，MyoD基因组梗死区内见多处条索状、孤岛状不一的新生肌肉组织，其周围血管丰富；透射电镜LacZ基因组和对照组梗死区见纤维细胞，MyoD基因组梗死区内见新生的带横纹的肌细胞，明暗带清晰，未见闰盘结构；免疫组化显示MyoD基因组梗死区内的肌肉组织骨骼肌肌球蛋白重链阳性，而cTnI阴性；TTC染色心肌存活区呈红色，梗死区不着色，三组心脏左心室面积无显著差异(P＞0.05)，MyoD基因组梗死厚度、梗死区面积及其占左心室面积的百分比明显小于对照组和LacZ基因组(P＜0.01)。 结论：MyoD基因重组腺病毒注入心肌梗死部位可以诱导骨骼肌样细胞分化，修复心肌损伤。 第三节局部注射MyoD基因重组腺病毒对心肌梗死后心功能的影响 目的：研究MyoD基因重组腺病毒局部注入梗死区组织后对心功能的影响。 方法：50只SD大鼠以开胸结扎冠状动脉前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功45只，随机分为对照组、LacZ基因组和MyoD基因组，每组15只，心梗后1周MyoD基因组在心肌梗死区注入100ul内含2×1010pfuMyoD基因重组腺病毒的无血清DMEM，LacZ基因组注入同样剂量LacZ基因重组腺病毒，对照组予以等量无血清DMEM培养液接种。心梗后1周干预治疗前(1wk)和心梗后5周(5wk)分别行心脏二维超声心动图及MPA心功能分析系统检测心功能。另从50只实验大鼠中随机检测15只大鼠冠状动脉结扎前心功能作为正常组。

目录

缩略语

前言

第一部分MyoD基因重组腺病毒载体的构建

第二部分MyoD基因诱导体外培养大鼠心肌成纤维细胞向骨骼肌成肌细胞分化的实验研究

第三部分MyoD基因局部转染心肌成纤维细胞治疗心肌梗死的实验研究

前言

第一节大鼠急性心肌梗死模型的建立

第二节局部注射MyoD基因重组腺病毒修复心肌梗死后心肌损伤的实验研究

第三节局部注射MyoD基因重组腺病毒对心肌梗死后心功能的影响

致谢

分子性心肌成形术的研究进展

博士在读期间科研工作小结

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