骨髓间充质干细胞颅内移植联合应用促红细胞生成素治疗创伤性颅脑损伤的实验研究

摘要

目的：
　　本实验通过体外分离并培养大鼠的骨髓间充质干细胞(bone marrow stemcells，BMSCs)，对其进行鉴定后并应用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic ironoxid，SPIO)对其进行标记，并通过Feeney's法建立大鼠创伤性颅脑损伤(traumatic braininjury，TBI)模型，然后将SPIO标记的BMSCs移植到TBI模型大鼠脑组织内，并联合应用重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO），从大鼠的行为学、影像学及组织学方面综合评价大鼠神经功能的恢复情况，并探讨两者联合应用的神经保护的作用及其机制，为临床应用rhEPO联合BMSCs治疗TBI提供实验依据。
　　方法：
　　1、采用全骨髓贴壁筛选法分离、培养大鼠BMSCs，培养过程中在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，并应用流式细胞仪技术鉴定细胞的表面抗原CD29、CD34、CD45和CD90。将培养的第3代细胞用于后续实验。
　　2、采用一定浓度的SPIO标记培养的第3代BMSCs，运用普鲁士蓝染色检测其标记率，并检测细胞在标记前后活力变化。
　　3、取120只SD雄性大鼠，采用Feeney's法建立大鼠TBI模型，随机分为4组，每组30只。A组:对照组，TBI模型建立后不给予任何治疗;B组:TBI模型建立后给予腹腔注射rhEPO治疗;C组:TBI模型大鼠给予SPIO标记的BMSCs脑内移植;D组:TBI模型大鼠给予SPIO标记的BMSCs脑内移植及联合注射rhEPO治疗。
　　4、各组实验大鼠在细胞移植后第1d、3d、7d、14d和28d采用改良的神经功能缺损法(NSS)进行神经功能评分，评价BMSCs移植及应用rhEPO的疗效。
　　5、采用干湿法测定不同时间点损伤周围脑组织的含水量。
　　6、分别于TBI模型建立后24h、细胞移植后28d，对大鼠脑组织进行苏木精-伊红染色以观察损伤脑组织的病理改变及恢复情况。
　　7、于各时间点进行颅脑MRI检查，动态观察标记的BMSCs的分布及迁移，最后于移植后第28d每组取2只大鼠处死后行脑组织普鲁士蓝染色，验证标记细胞在脑内的存活及迁移情况。
　　结果：
　　1、通过全骨髓贴壁筛选法培养细胞，培养24h后，可见部分细胞开始贴壁，多呈圆球形和梭形;当培养至第7d时，细胞呈集落样贴壁生长，集落逐渐扩大，相邻细胞间相互融合，排列紧密，细胞胞体增大，多呈梭形。细胞经培养传代后，细胞呈梭形成纤维样生长，形态单一，分布均匀。流式细胞仪检测结果显示，第3代的BMSCs表面CD29、CD90表达阳性，而CD34、CD45表达阴性。
　　2、Fe浓度为25ug/ml的SPIO标记BMSCs后48h，经细胞涂片行普鲁士蓝染色，倒置显微镜下观察见所有标记细胞内均可看到蓝色的铁颗粒，颗粒在细胞质中，呈簇状或散在分布，细胞标记率为100％。标记SPIO和未标记SPIO的BMSCs的活细胞比率分别为98.5％、99％，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3、各组大鼠在细胞移植术后随着时间延长NSS评分不断降低，不同时间点差异有统计学意义(P＜0.05); rhEPO治疗组、BMSCs治疗组、rhEPO+BMSCs治疗组术后不同时间点评分明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05); rhEPO+BMSCs治疗组在不同时间点评分明显低于rhEPO治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05);rhEPO+BMSCs治疗组在移植后第7d、14d、28d三个时间点评分明显低于BMSCs治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、脑组织含水量测定结果显示:大鼠颅脑损伤后第3d脑组织含水量最高。移植后第7d各组脑组织含水量较第3d明显降低，存在显著性差异(P＜0.05);第14d时各组脑组织含水量与第7d相比降低，差异具有统计学意义(P＜0.05);第7d、14d时rhEPO治疗组、BMSCs治疗组、rhEPO+BMSCs治疗组脑组织含水量与对照组相比，含水量差异有统计学意义(P＜0.05)，rhEPO+BMSCs治疗组与rhEPO治疗组、BMSCs治疗组相比，脑组织含水量降低更明显，差异存在显著性意义(P＜0.05)。
　　5、HE染色结果显示:脑组织损伤后24h可见到脑组织断裂，结构紊乱，形成较多的空洞，伴有神经纤维疏松，胞体皱缩，间质水肿明显，部分神经细胞变性坏死。脑组织损伤后28d时对照组、BMSCs治疗组和rhEPO+BMSCs治疗组均可见损伤区域可见梗死灶，神经细胞胞体皱缩，胞浆浓缩红染，胞核固缩、溶解，神经细胞变性坏死，神经细胞明显较少。部分脑组织断裂，有瘢痕连接，组织结构紊乱。rhEPO+BMSCs治疗组与另外两组相比，神经细胞变性坏死的数目明显变少，间质水肿也较轻。
　　6、MRI显示移植后第1d、3d可见移植部位为团块状类圆形低信号影，边界光滑清晰，损伤部位表现局部小面积的梗死。细胞移植后第7d，BMSCs治疗组和 rhEPO+BMSCs治疗组都可见移植部位的低信号影较前扩大，边界略显模糊;损伤脑组织局部高信号影扩大，甚至远离损伤部位也显示高信号，rhEPO+BMSCs治疗组与BMSCs治疗组相比，局部高信号影略少。细胞移植后第14d，可见沿胼胝体腹侧走形的线性低信号影，与移植部位相连，BMSCs治疗组线性低信号影长度较rhEPO+BMSCs治疗组短，rhEPO+BMSCs治疗组梗死病灶皮层下可见线性的低信号影;两组损伤部位高信号影都较第7d时较少;细胞移植后第28d，可见移植细胞迁移所致的沿胼胝体腹侧走形的线性低信号影向病损部位延伸，rhEPO+BMSCs治疗组可见低信号影向着梗死灶扇形分布，甚至跨越中线迁移至对侧缺血异常高信号区域边缘。
　　7、细胞移植后第28d大鼠脑组织切片普鲁士蓝染色结果显示SPIO标记的BMSCs沿着胼胝体迁移形成细胞迁移流，呈条带状，其迁移形状与MRI结果相符。
　　结论：
　　1、采用全骨髓培养贴壁法可以较为简便而有效地获取均质性良好的大鼠BMSCs;细胞在形态学、表面标志物表达方面具有干细胞的生物学特性。
　　2、SPIO在适当的标记浓度、标记时间时可以简便有效地标记大鼠BMSCs，且不影响干细胞的生物学活性。
　　3、采取将BMSCs移植到TBI大鼠脑组织内联合应用rhEPO，大鼠的神经功能缺损评分明显下降，大鼠的运动功能、感觉功能等明显改善，损伤脑组织含水量明显降低，有效的降低脑组织水肿及改善神经功能。
　　4、将标记有SPIO的BMSCs移植入大鼠脑内，通过MR成像可以活体动态观察BMSCs在脑内的迁移及分布情况，观察到BMSCs可以向损伤脑组织部位定向迁移。
　　5、大鼠行为学、影像学及组织学检测结果显示，联合应用细胞移植和应用rhEPO治疗TBI大鼠比单一应用一种治疗手段更有效，二者相互作用促进了大鼠神经功能的恢复，为TBI的细胞治疗提供了新的策略。

目录

声明

摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

绪论

文献综述 骨髓间充质干细胞移植治疗颅脑损伤的研究进展

第1章 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、鉴定及标记

1．1 前言

1．2 材料和方法

1．2．1 主要材料、试剂和仪器

1．2．2 实验方法

1．3 结果

1．3．1 骨髓间充质干细胞形态学观察

1．3．2 细胞生长曲线

1．3．3 骨髓间充质干细胞表面标志物的表达

1．3．4 BMSCs的体外标记观察及标记率测定

1．3．5 标记细胞的活力检测结果

1．4 讨论

1．5 小结

第2章 骨髓间充质干细胞移植联合应用促红细胞生成素治疗创伤性颅脑损伤大鼠

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 主要材料、试剂和仪器

2．2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 神经功能缺损评分

2．3．2 MRI连续动态观察及脑组织普鲁士蓝染色

2．3．3 HE染色

2．3．4 脑组织含水量测定

2．4 讨论

2．5 小结

结论

问题与展望

致谢

参考文献

作者简介