Rheb1在出生后小鼠心脏生长及功能维持中的作用研究

摘要

背景: 儿童心力衰竭是严重威胁小儿健康的世界性难题。在婴儿期间，心脏发育的特点是快速生长和生理性重构。出生后各种原因引起的心脏生长和重构异常导致心脏发育异常，最终发展成心力衰竭。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路调控出生后心脏生长，Akt通过激活下游哺乳动物雷帕霉素靶点蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1）控制蛋白质合成、能量代谢、凋亡和自噬等重要生命过程。脑组织富含的Ras同源物1(rashomologue enriched in brain，Rheb1)是mTORC1上游分子，属于小GTP酶Ras超家族成员。以往主要研究了Rheb1在成年大鼠和小鼠心肌细胞中的作用。如Rheb1通过激活mTORC1信号通路调控成年大鼠心肌细胞生理性肥厚过程。我们课题组前期研究表明，Rheb1通过mTORC1信号通路调控成年小鼠心脏病理性重构。关于Rheb1在出生后（幼年）心脏生长中的作用尚不清楚。 目的: 探究Rheb1在小鼠出生后心脏生长及生理性重构中的作用。 方法: 通过心脏特异性基因敲除方法，在小鼠出生后心肌细胞中敲除Rheb1。通过大体形态、组织切片、特殊染色和电镜，观察Rheb1心肌特异性敲除小鼠心脏结构的变化，同时测量Rheb1敲除小鼠的重要生理参数体重、心重和心重体重比。通过离体心脏灌流的方法分离心肌细胞，观察Rheb1心肌特异性敲除小鼠心肌细胞形态学变化。通过心脏超声和心电图观察Rheb1敲除对小鼠心脏功能和电活动的影响。通过蛋白印迹(western blot)、实时定量荧光聚合酶链反应(realtime quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和免疫荧光方法检测mTORC1信号通路、Akt信号通路、自噬和凋亡标记物和代谢相关基因的变化，对Rheb1敲除相关表型的分子机制进行研究。最后通过进一步敲除磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，Pten）和Akt1改变Akt活性，观察改变Akt活性变化对Rheb1敲除小鼠存活的影响。 结果: 各种基因型小鼠出生比例符合孟德尔遗传学规律。Rheb1基因在出生后第三天部分敲除，第五至七天完全敲除。Western blot检测提示，Rheb1蛋白水平在出生后第七天较对照组显著下降。Rheb1敲除小鼠出生后第11天开始死亡，第16天全部死亡，中位生存时间12.5天。正常小鼠心脏重量和心肌细胞面积随时间而增加，Rheb1敲除小鼠心脏重量和心肌细胞面积第九天开始停止增加，心重体重比显著低于对照组。麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)染色示Rheb1敲除小鼠出生后第9天心肌细胞数目较对照组显著减少。Rheb1敲除组小鼠体重于死亡前1-2天下降并显著低于对照组。与正常对照组小鼠比较，Rheb1敲除小鼠第十天出现左室射血分数显著下降和恶性心律失常，左室舒张末内径第12天显著增大。电镜检测发现Rheb1敲除小鼠心肌线粒体较对照组显著受损。TUNEL和凋亡标记物检测发现Rheb1敲除小鼠心肌细胞凋亡较对照组显著增加。与对照组相比，Rheb1敲除组自噬标记物LC3Ⅰ水平显著降低，而LC3Ⅱ水平没有相应增加。Western blot和qPCR检测显示，与对照组相比，Rheb1敲除组mTORC1下游信号分子核糖体蛋白6（ribosomal protein6，S6）和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic initiation factor4E binding protein1，4E-BP1）磷酸化水平显著下降，代谢相关基因显著下调。进一步凋亡相关信号分子检测发现，Rheb1敲除小鼠内质网应激标记物capspase12、C/EBP同源物蛋白(C/EBPhomologous protein，CHOP)、磷酸化c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、激活作用转录因子6（activating transcription factor6，ATF6）和剪切的X盒结合蛋白-1(spliced X-box binding protein-1，sXBP)较对照组显著上调。与对照组相比，Rheb1敲除组Akt活性显著增加。通过Rheb/Pten双敲除提高Akt活性可以延长Rheb1敲除小鼠存活。 结论: Rheb1是小鼠出生后心脏mTORC1信号激活所必需，Rheb1通过激活mTORC1信号调控出生后心肌细胞生长、能量代谢、存活、心脏功能及电生理稳态。在小鼠出生后心脏中，Rheb1-mTORC1信号和内质网应激相关信号存在对话，调控出生后心肌细胞凋亡。Rheb1可能通过mTORC1依赖与非mTORC1依赖的方式调控出生后心肌细胞自噬。提高Akt活性有助于改善幼年心衰小鼠存活。

目录

声明

摘要

前言

1．材料方法

2．统计分析

3．结果

3．1．α-MHC-Cre特异性和Rheb1敲除效率检测

3．2．Rheb1敲除小鼠表现为心脏扩大、心力衰竭、心律失常和未成年死亡

3．3．Rheb1 cKO小鼠心脏生长阻滞

3．4．Rheb1 cKO小鼠心肌代谢异常、凋亡增加，但对自噬没有影响

3．5．Rheb1 cKO小鼠心肌发生内质网相关凋亡通路改变

3．6．Rheb1 cKO小鼠心肌mTORC1信号受损、Akt信号激活

3．7．提高Akt活性延长Rheb1 cKO小鼠存活

4．讨论

4．1．Rheb1在出生后心脏生理性重构中起重要作用

4．2．Rheb1是小鼠出生后mTORC1激活所必需

4．3．Rheb1-mTORC1通过ER应激信号诱导心肌细胞凋亡

4．4．Rheb1可能以mTORC1依赖和非mTORC1依赖的方式调节自噬

4．5．提高Akt活性改善心衰小鼠存活

结论

局限性

参考文献

缩略词表

Rheb生物学功能研究进展

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