The Detailed Study on the Development of Magnetic Seperation and Chemiluminescence Based Biosensor for the Simultaneous Detection of Multiple Viruses

摘要

基于磁性纳米颗粒的细胞，细菌和病毒核酸的提取方法研究
　　核酸(NA)提取是进行遗传研究和DNA传感器开发的关键步骤。核酸抑制剂的存在会妨碍核酸的下游应用。这些盐离子和其他有机污染物给DNA生物传感器的开发及灵敏的分析提出了挑战。我们提出了基于磁珠分离核酸的方法，并对可能影响核酸分离的因素进行了优化。结果表明，6M的胍盐酸盐的浓度为分离核酸的最优浓度，核酸的裂解缓冲液和浓度和pH与核酸产量成负相关，核酸产量为在pH4-5的环境下相对稳定。可以看出，使用carrier RNA在病毒基因组分离中是十分重要的。当加入1∶1的比例乙醇至溶解物能够大大提高核酸产量。无DNA酶和RNA酶水，1×TE缓冲液和2×PCR缓冲液洗脱效率进行比较可以看出，carrier RNA在DNA酶和RNA酶自由水和1×TE缓冲液中洗脱效率最佳。从大量的细胞中提取核酸用较大的洗脱缓冲液的体积洗脱效果更佳。本研究建立了一种简单的方法，从细胞，细菌和血清提取核酸。将纯化的核酸成功扩增PCR中和RT-PCR，以验证此方法的可靠性。使用纳米颗粒可以促进使用这种方法在自动化核酸提取仪开发和应用，可用于高通量半自动或全自动诊断系统的发展。
　　基于PCR扩增和化学发光乙肝病毒的高灵敏度检测
　　HBV感染已被认为可以引发一系列严重的疾病，如肝细胞癌(HCC)，肝内胆管细胞癌和非霍奇金淋巴瘤。对这一感染的早期诊断对疾病的治疗以及抑制疾病传播至关重要。目前的分子检测系统价格昂贵，而且需要高技能的劳动力进行测试和处理数据。本研究提出了一个通过结合磁分离，多重PCR和化学发光技术的高灵敏度、可自动化检测临床样品乙肝病毒检测方法。对可能影响PCR的因素，如引物浓度，PCR缓冲液浓度，氯化镁浓度(MgCl2)，引物的Taq DNA聚合酶的浓度和PCR的退火温度进行优化，以获得最大的产量。探针-模板杂交温度进行了探索研究，最终得到杂交温度为45℃。优化的探针浓度为5μM。最佳杂交时间被确定为30分钟。用50μg探针修饰的磁珠产生最大化学发光信号。当用HCV和HIV感染的血清替换HBV血清时，检测获得阴性信号。该方法可检测10病毒拷贝/毫升血清的HBV病毒，有很好的灵敏度。
　　基于PCR扩增和化学发光丙肝病毒的高灵敏度检测
　　丙型肝炎病毒(HCV)是全世界的主要威胁之一。感染了这种病毒会导致慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)的发生。研发成本低廉的诊断工具，以便及早发现丙型肝炎病毒的发展是在发展中国家是非常必要的。本研究建立了一种基于磁性纳米颗粒和化学发光的HCV检测方法。利用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对HCV-RNA进行扩增，以实现较高的灵敏度的检测。PCR的引物退火温度被确定为58℃。在1.5×PCR缓冲液浓度下，获得最佳的扩增效果。同时对MgCl2和引物的浓度进行了优化，最佳浓度分别2.4μM和200 nM。热启动Taq DNA聚合酶的最佳用量为1.5U/50μl。探针和模板杂交的最佳在温度为55℃。最适探针浓度为5μM。当杂交在30分钟时记录得到最大的化学发光信号。该方法成功地检测到10病毒颗粒/毫升血清，有较好的特异性和灵敏度。
　　基于磁性分离和化学发光的艾滋病毒检测方法研究
　　人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的致病病毒。自从艾滋病病毒被发现至信今已造成超过2500万人死亡，每年报告新增艾滋病毒感染者270万。因此，研究一种新的廉价有效的HIV病毒诊断方法极为重要。本研究介绍了一种基于DNA杂交和化学发光的HIV检测分析。利用一步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)用于扩增的HIV靶序列。最佳退火温度为58℃。Biotin-11-dUTP掺入到一步法RT-PCR扩增反应中，使扩增产物标记上Biotin。探针修饰的磁珠被用来捕获这些靶序列，并生成检测信号。本论文对可能会影响化学发光信号的不同因素进行了优化，最后得到最佳杂交温度是35℃。5μM的探针浓度产生最大的化学发光信号。最佳杂交时间为30分钟。这种方法显示出良好的特异性。当HCV和HBV感染的血清替换HIV血清时，得到的阴性信号。该系统成功地检测到10病毒拷贝/毫升HIV血清。
　　基于磁性纳米颗粒和化学发光分析同时提取和检测多种病毒
　　相比于酶联免疫(ELISA)测定方法，基于核酸检测的方法更为灵敏。多种试验方法已经被用于检测多种病原体，并能降低核酸检测的成本。但是，这些测定法无法可靠地检测大量病原体。在本研究中，建立了一个基于DNA杂交的化学发光检测方法，被并用于同时检测多种病原体而对病原体的数目没有限制。通过开展HBV，HCV和HIV的同时提取和检测，探头具有较高的特异性可捕获病毒序列。在其它病毒有更高负载的存在时仍可检测到单个病毒，该试验可以检测10拷贝/毫升血清10拷贝/毫升HCV血清和100拷贝/毫升HIV血清。基于磁分离技术从核酸提取到化学发光检测，该方法可以整合到一个自动化系统用于便捷地高通量病原休检测。

目录

声明

Abstract

摘要

Table of Contents

Chapter Ⅰ Introduction

1．1．Overview

1．2．Genetic variation in viral genome and their geographical distribution

1．3．Progress of research for in diagnosis

1．4．The purpose of this study

1．5．The significance of this study

REFERENCES

Chapter Ⅱ Development of Magnetic Beads Based Protocol for the Purification of High Quality Nucleic Acids from Cells，Bacteria and Virus

2．1 Introduction

2．2 Materials and Methods

2．2．1 Materials

2．2．2 Methods

2．3 Results and Discussion

2．3．1 Viral Genome Extraction

2．3．2 Nucleic Acid Extraction from Cells(Hep G2 Cells)

2．3．3 Nucleic acid Extraction from Bacteria (E．coil strain DH5α)

2．4 Conclusion

2．4．1 Preparation of NA extraction kit

2．4．2 Application of NA extraction kit for viral genome extraction

2．4．3 Application of NA extraction kit for NA extraction from cell culture

2．4．4 Application of NA extraction kit for NA extraction from Bacteria

REFERENCES

Chapter Ⅲ Highly Sensitive Detection of HBV Based on PCR Amplification and Chemiluminescent Detection

3．1．Introduction

3．2．Materials and Methods

3．2．1．Materials

3．2．2．Methods

3．3．Results and Discussion

3．3．1 Polymerase Chain Reaction Amplification

3．3．2．Chemiluminescent Detection

3．4．Conclusion

3．4．1．Designed the primer pair and probe for targeting all genotypes of HBV

3．4．2．Established the optimized conditions for HBV genome amplification

3．4．3．Established the best probe and PCR amplicon hybridization conditions

3．4．4 Applied magnetic separation and chemiluminescence technique for establishing the specificity and limit of detection of HBV from serum

REFERENCES

Chapter Ⅳ Magnetic Separation and Chemiluminescence Based Highly Sensitive Method for HCV Detection

4．1．Introduction

4．2．Materials and Methods

4．2．1．Materials

4．2．2．Methods

4．3．Results and Discussion

4．3．1．Polymerase Chain Reaction Amplification

4．3．2．Chemiluminescent Detection

4．4．Conclusion

4．4．1．Designed the primer pair and probe for targeting all genotypes of HCV

4．4．2．Established the optimized conditions for HCV genome amplification

4．4．3．Established the best probe and PCR amplicon hybridization conditions

4．4．4．Applied magnetic separation and chemiluminesce technique for establishing the specificity and limit of detection

REFERENCES

Chapter Ⅴ Magnetic Separation and Chemiluminescent Based Highly Sensitive Method for HIV Detection

5．1．Introduction

5．2．Materials and Methods

5．2．1．Materials

5．2．2．Methods

5．3．Results and Discussion

5．3．1 Polymerase Chain Reaction Amplification

5．3．2．Chemiluminescent Detection

5．4．Conclusion

5．4．1．Designed the primer pair and probe for targeting all group M genotypes of HIV-1

5．4．2．Established the optimized conditions for HIV genome amplification

5．4．3．Established the best probe and PCR amplicon hybridization conditions

5．4．4．Applied magnetic separation and chemiluminesccence technique for establishing the specificity and limit of detection

REFERENCES

Chapter Ⅵ Development of a Chemiluminescence Based Assay for Simultaneous Extraction and Detection of Multiple Viruses

6．1．Introduction

6．2．Materials and Methods

6．2．1．Materials

6．2．2．Methods

6．3．Results and discussion

6．3．1．RT-PCR and gel electrophoresis

6．3．2．Chemiluminescent Detection

6．4．Conclusion

6．4．1．Primer pairs were designed to work in multiplex PCR

6．4．2．Established the optimized conditions for multiplex amplification to achieve higher sensitivity

6．4．3 Applied magnetic separation and chemiluminesce technique for establishing the specificity and limit of detection of each virus

REFERENCES

Chapter Ⅶ Semi-Automated System for Multiplex Viral Detection

7．1．Introduction

7．2．Materials and Methods

7．2．1．Materials

7．2．2．Methods

7．3．Results and Discussion

7．3．1．Optimization of MPs related parameter

7．3．2．Optimization of Wash Ⅰ

7．3．3．Optimization of Wash Ⅱ

7．3．4．One step Multiplex RT-PCR and gel electrophoresis

7．4．Conclusion

7．4．1．Optimization of parameters for Automated Nucleic Acid extraction

7．4．2．Development of semi-automated system for multiplex detection

REFERENCES

Chapter Ⅷ Summary of the Project and Future Work Plan

8．1．Summary and conclusions

8．2．Directions for Future work

Appendix

Acknowledgement