5-羟色胺对冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移和窦房结自律性的影响

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 5-羟色胺促人冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移的研究
　　目的：观察不同浓度5-羟色胺(5-HT)对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMC)增殖、迁移的影响及作用机制。
　　方法：体外培养hCASMC，予以不同浓度(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/l)的5-HT，观察各种浓度的5-HT对hCASMC的增殖能力(MTT法)和迁移能力（迁移小室法）。分别给予5-羟色胺转运体(5-HTT)抑制剂氟西汀(10-5 mol/l)、西酞普兰((10-6 mol/l)和5-HT受体(5-HTR)阻断剂GR127935(10-6 mol/l)、ketanserin(10-7 mol/l)，观察5-HTT和5-HTR阻断剂在5-HT诱导的hCASMC增殖迁移中的作用。通过高效气相液相色谱检测胞质内5-HT含量，观察5-HTT阻断剂对于胞内5-HT含量的影响。使用重组腺病毒5-HTT编码基因载体过表达hCASMC5-HTT，观察过表达5-HTT对5-HT诱导的hCASMC增殖、迁移的影响。
　　结果：(1)细胞生长良好，形态多样，多数呈典型纤维样细胞，呈梭形、长梭形、或带状，细胞伸出较长突起相互接触，少数呈三角形或星型，核卵圆形居中，SM-α-肌动蛋白鉴定阳性。(2)不同浓度5-HT对hCASMC的增殖活力相比较，结果显示:与对照组相比，浓度为10-7 mol/l的5-HT的诱导下细胞增殖活力增加(P＜0.01)，促增殖作用在10-5mol/l时达顶峰，5-HT浓度超过10-5mol/l时细胞增殖率开始下降。(3)5-HTT阻断剂氟西汀或西酞普兰均可有效抑制5-HT诱导的hCASMC增殖和迁移，与5-HT组相比有显著性差异(P＜0.01)，这一作用可能与hCASMC胞内摄入的5-HT减少相关;5-HTR拮抗剂GR127935和ketanserin对5-HT诱导的hCASMC增殖无明显影响。(4)过表达5-HTT基因的hCASMC对5-HT诱导的细胞增殖、迁移作用显著增加(P＜0.05)。
　　结论：5-HT明显促进hCASMC增殖和迁移，5-HTT在5-HT诱导的人冠状动脉平滑肌细胞增殖和迁移中起重要作用。
　　第二部分 5-羟色胺转运体在血管损伤后的表达变化及调控因素
　　目的：检测血管损伤发生时5-羟色胺转运体(5-HTT)的表达和炎症因子对其的调控作用。
　　方法：使用大鼠颈动脉球囊损伤模型，western blot检测发生损伤后狭窄段颈动脉白细胞介素1-beta(IL-1β)和5-HTT表达。给予IL-1β(10 ng/ml)及IL-1受体拮抗剂(IL-1ra10 ng/ml)干预体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMC)，检测其对5-HTT表达的影响。给予IL-1β干预表达5-HTT的HEK293细胞，膜片钳检测5-HT诱导的电流，检测IL-1β对5-HTT功能的影响。
　　结果：(1)球囊损伤损伤3天后，新生内膜开始形成，7天后新生内膜已经形成并增厚，以后血管平滑肌细胞继续增生，内膜继续增厚。(2)颈动脉球囊损伤后组织IL-1β表达增加，于第7天达到高峰，第21天仍明显高于对照组(p＜0.05);5-HTT表达增加，于14天达到高峰(p＜0.05)。(3) IL-1β上调hCASMC5-HTT表达，增强HEK293-5-HTT细胞5-HT诱导电流，IL-1受体拮抗剂可抑制这一作用。
　　结论：5-HTT和IL-1β在血管损伤后狭窄过程中表达增加;而IL-1β可以上调5-HTT表达和促进5-HTT功能。
　　第三部分 心肌蛋白5-羟色胺化修饰及其对窦房结细胞自律性影响研究
　　目的：检测并筛选心肌细胞受5-羟色胺化作用的靶点，通过生物仿真预测和分析其对窦房结自律性的影响及机制。
　　方法：分离单个大鼠心肌细胞，分为四组:a:心肌细胞未与5-HT孵育且加入了转谷酰胺酶抑制剂(Dansylcadaverine，DSC)和钙离子螯合剂EGTA，b:心肌细胞以1mM5-HT和6.7 mM CaCl2处理，c:心肌细胞预先给予0.2mMDSC孵育10min后再加入1 mM5-HT处理，d:心肌细胞预先给予5mMEGTA后再加入1mM5-HT处理。提取蛋白，使用5-HT抗体和Protein A Agarose进行蛋白质免疫共沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和快速银染，选择符合5-羟色胺化特点的蛋白质条带进行蛋白质质谱分析。应用窦房结计算机数学心脏模型，对所筛选的蛋白进行生物仿真，探讨其对窦房结节律的影响和机制。
　　结果：分离的大鼠单个心肌细胞表面光滑、边缘和横纹清晰，细胞呈长杆状，具有良好透光度。5-羟色胺化检测发现分子量100 kDa附近一条带蛋白量受DSC和EGTA影响明显减少，提示为符合5-羟色胺化特征的蛋白质条带。蛋白质质谱分析鉴定目的条带为肌内质网钙三磷酸腺苷酶2a(SERCA2a)。利用窦房结细胞计算机数学模型的仿真提示SERCA正向钙亲和力降低或反向钙亲和力增加以及轻度内质网钙泄漏引起窦房结节律增快，反之SERCA正向钙亲和力增加或反向钙亲和力降低以及严重内质网钙泄漏引起窦房结节律减慢。
　　结论：SERCA2a可被5-HT进行5-羟色胺化修饰，SERCA钙亲和力改变既可引起窦房结节律增快也可引起窦房结节律减慢。

目录

声明

摘要

本文所用缩略语注释表

前言

文献综述

第一部分 5-羟色胺及5-羟色胺转运体对人冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移影响的研究

1．1．前言

1．2．试剂与器材

1．3．主要实验方法

1．4 结果

1．5 讨论

1．6 结论

参考文献

第二部分 5-羟色胺转运体在血管损伤后的表达变化及调控因素

2．1 前言

2．2 试剂与器材

2．3 主要实验方法

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

第三部分 心肌蛋白5-羟色胺化检测及其对窦房结自律性影响研究

3．1．前言

3．2．试剂与器材

3．3．主要实验方法

3．4．结果

3．5．讨论

3．6．结论

参考文献

全文总结与展望

致谢

作者简介