心脏发育相关lncRNAs的筛选及uc.167在胚胎心脏发育中的功能与机制的研究

摘要

背景：先天性心脏病(Congenital Heart Disease，CHD)是由于胎儿的心脏在母体内发育缺陷或部分发育停顿所造成的畸形，简称先心病，发病率0.8-1％，是目前最常见的出生缺陷，而且也一直是引起婴幼儿死亡的首要原因。我国每年新增CHD婴儿约16-20万，CHD不仅可导致胎儿生长发育迟缓，而且常导致流产、死胎等。如果CHD得不到及时救治，30％的婴儿在婴儿期死亡，即使存活也常继发心、脑、肺等重要器官损害，严重影响患儿的生活质量及身心健康，给家庭及社会带来沉重的经济压力和精神负担。因此，深入探讨胚胎心脏发育畸形的机制，从根本上控制和降低先心病的发生率，已成为预防医学领域早期防治的一个重点研究内容。先天性心脏病（CHD）的病因迄今尚未完全阐明，尽管多数学者认为CHD是胚胎心脏从原始心管到发育成熟过程中由环境和/或遗传因素共同作用导致的发育异常，但研究发现单纯由环境因素引起的CHD仅占2-5％，更多的则与遗传或基因缺陷有关。心脏发育过程极其复杂，涉及许多相关基因依时空顺序差次表达以及多条信号通路的精确调控，任何环节出现紊乱都有可能影响心脏发育、导致CHD的发生。目前已发现，Nkx2-5、GATA4、MEF2A、MEF2C、TBX5等基因以及Wnt、Notch等信号通路与心脏发育密切相关，为理解先心病的发生发展提供了分子基础与线索，但胚胎心脏发育异常的分子调控网络尚未完全清楚，因此继续挖掘新的调控因子仍极其重要。本研究分为三个部分：
　　第一部分：心脏发育相关lncNRAs的筛选与整合分析。
　　目的：⑴检测室间隔缺损胚胎心脏与正常对照心肌组织之间的lncRNAs表达谱;⑵筛选与心脏发育异常相关的lncRNAs，为后续功能研究提供数据积累。
　　方法：①以超声诊断为室间隔缺损的人孕17周胚胎心脏组织样本为检测对象、同孕周非疾病因素人工流产的胚胎心脏组织样本为对照，采用美国Arraystar公司lncRNAs芯片技术检测两组之间lncRNAs和mRNAs的表达情况，对原始数据预处理、均一化后进行统计分析，以2倍以上变化且具有统计学意义(P＜0.05)为判断标准，筛选出差异表达的lncRNAs和mRNAs;②随机选取芯片结果中差异表达的10条lncRNAs，采用Real-Time PCR方法验证芯片数据的重复性与可靠性;③对差异表达的mRNAs进行GO分析和KEGG通路分析;④依据序列保守性、心脏发育相关性、组织特异性等标准，筛选出与心脏发育可能密切相关的lncRNAs;⑤对筛选出的lncRNAs进行生物信息学分析，预测其靶基因及潜在的生物功能。
　　结果：⑴对芯片原始数据进行标准化处理和两组比较后，差异表达的lncRNAs为1508条，其中上调880条，下调628条;差异表达的mRNA1784条，其中上调691条，下调1093条;⑵RT-PCR验证结果与芯片数据基本一致;⑶GO分析结果显示，差异表达的lncRNAS主要涉及发育过程、细胞增殖、细胞周期、细胞分化、DNA复制、DNA修复、糖分子绑定、蛋白绑定、细胞表面以及一些糖、腊代谢等功能。Pathway分析结果显示，差异表达的lncRNAS参与的信号通路包括JAK-STAT signaling pathway、Wntsignaling pathway、Hedgelog signaling pathway等，这些信号通路与心脏发育密切相关;⑷通过制定的筛选标准共筛选出10条与心脏发育密切相关的lncRNAs，它们都有较高的保守性与组织特异性，分别为:ENST00000513542、RP11-473L15.2、uc.167、HIT000242541、BX648912、BC040935、AY927503、LOC440839、 G65566、AK127225;⑸生物信息学分析显示ENST00000513542、RP11-473L15.2这两条lncRNAs染色体区域存在丰富的表观遗传调控信息，包括多种组蛋白修饰方式、DNA甲基化等，并且受多个发育相关转录因子结合调控。
　　结论：①与正常对照相比，室间隔缺损胚胎心肌组织中的lncRNAs表达谱发生了显著变化，提示lncNRAs可能参与了心脏发育过程的调节。②经Real-time PCR验证，lncRNAs芯片结果可靠，可用于后续分析。
　　第二部分：lncRNA-uc.167的生物信息学分析及时空表达特征。
　　目的：⑴采用生物信息学方法探索uc.167潜在功能的重要性;⑵分析uc.167的基本生物学特征，包括uc.167在小鼠心脏发育过程中的空间分布特征、时间表达规律以及uc.167在P19细胞向心肌细胞分化过程中的时间表达规律。
　　方法：①借助ENCODE的UCSC genome browser对筛选出的lncRNAs进行初步的生物信息学分析;利用相关数据库预测与lncRNAs结合TFBs的元件。采用catRAPID algorithm预测RNA与蛋白之间相互作用;②取不同阶段(P8.5、P11.5、P14.5、P18.5)的胚胎小鼠心脏，使用RT-PCR方法检测uc.167及邻近基因在心肌组织中的表达情况，并采用原位杂交技术检测uc.167在心肌组织内的分布情况;③采用DMSO方法诱导P19细胞向心肌细胞方向分化，采用RT-PCR方法检测分化过程中uc.167及邻近基因的表达变化。
　　结果：⑴人uc.167全长201bp，定位于基因组5q14.3(chr5:88179623-88179824，GRCh37/hg19)，根据lncRNA分类原则，属Intronic antisense lncRNA;⑵uc.167相关染色体区域受CEBPB、GATA2、SRF等多个重要转录因子结合调控，该染色体区域存在非常丰富的表观遗传调控信息，如多种组蛋白修饰方式、DNA甲基化等;⑶uc.167主要表达于心室肌组织内;在小鼠胚胎心脏发育过程中uc.167表达逐渐下调，而其邻近基因Mef2c表达逐渐上调，两者呈相反趋势;⑷uc.167在P19细胞向心肌细胞分化的过程中，呈现“先升后降”的表达模式，在胚胎样小体形成(d4)时表达水平达到最高，而后逐渐下调，临近基因Mef2c的表达变化与其呈相反趋势。
　　结论：①uc.167可能具有重要的潜在的生物学功能;②uc.167可能通过负向调控其邻近基因Mef2c来发挥作用。
　　第三部分：lncRNA-uc.167在胚胎心脏发育中的功能与相关机制研究。
　　目的：⑴探索uc.167对P19细胞增殖、周期、凋亡及分化的影响及相关机制;⑵探索uc.167在小鼠心脏发育过程中的作用及可能机制。
　　方法：①设计并构建lncRNA-uc.167过表达载体，将其与空白对照载体分别转染P19细胞，并用嘌呤霉素筛选14d，采用RT-PCR方法验证并获得稳定表达细胞株，采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞仪检测uc.167过表达对P19细胞周期的影响、RT-PCR方法检测其对P19细胞分化的影响，并用磷脂酰外翻法、Capase-3活性检测及Hoechst染色等方法分析其对细胞凋亡的影响;②设计Mef2c过表达载体，与uc.167共转染P19细胞，检测P19细胞增殖、周期、凋亡及分化情况;③通过胚胎显微注射方法构建uc.167心肌组织特异性转基因小鼠，采用心脏超声、HE、Masson染色等实验技术对其表型进行初步分析。
　　结果：⑴成功构建uc.167过表达载体并获得uc.167稳定过表达细胞株，uc.167过表达可显著抑制细胞增殖，使其受阻于S/G2期，并促进细胞凋亡，uc.167过表达显著抑制P19细胞向心肌细胞方向分化;⑵Mef2c与uc.167共同过表达可挽救uc.167过表达对P19细胞造成的不利影响;⑶在观察期内，uc.167转基因小鼠并未出现明显的心脏畸形表型:与正常对照相比，转基因小鼠的心脏结构、心功能参数均无明显变化;心肌组织形态结构、纤维化程度也未发生显著变化。
　　结论：①uc.167过表达可产生明显的细胞表型，显著影响P19细胞的增殖、周期、凋亡及细胞分化;②uc.167可能通过负向调控其临近基因Mef2c发挥生物学功能;③uc.167在心脏发育过程中具有一定的调节作用，但并不是唯一性、关键性的，而是可能作为一个“微效基因”与其他基因共同发挥调控作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 心脏发育相关lncRNAs筛选与整合分析

研究背景

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 lncRNA-uc．167的生物信息学分析及时空表达特征

研究背景

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 uc．167在胚胎心脏发育中的功能与相关机制研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

缩略语

综述

参考文献

附录

致谢