卡波氏肉瘤病毒(KSHV)编码的miR-K6-3p通过调控SH3BGR/STAT3信号通路促进内皮细胞迁移与血管生成

摘要

背景:卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma，KS)是由卡波氏肉瘤病毒（Kaposi'ssarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染引起的一种以血管异常增生和高度侵袭转移为特征的恶性肿瘤。KSHV体外感染内皮细胞能够显著增强细胞的侵袭与血管生成能力。KSHV编码12个前体微小RNA(precursor microRNA，pre-miRNA)，最终生成25种成熟miRNAs，这些miRNAs在KS肿瘤转移和血管生成中的作用目前尚不清楚。
　　目的:研究KSHV编码的miR-K6-3p对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)迁移和血管生成能力的影响，并探讨其中涉及的分子机制。
　　方法:首先构建表达miR-K6-3p的重组质粒mpCDH-miR-K6-3p。通过三质粒表达系统包装重组慢病毒Lentivirus-K6-3p及其对照Lentivirus-mpCDH并分别感染HUVECs，进行Transwell小室迁移、微管形成和基质胶栓塞(PLUG)实验，观察miR-K6-3p对内皮细胞迁移和血管生成的影响。为了鉴定miR-K6-3p的靶基因，运用质谱分析技术获得miR-K6-3p和mpCDH两组细胞的差异蛋白表达谱。通过多种生物信息学软件，包括TargetScan、RNAhybrid、Findtar和PicTar等分析，筛选出miR-K6-3p的候选靶基因，结合虫荧光素酶(Luciferase)报告实验、点突变实验和免疫印迹(Western blot)进行鉴定。通过检测候选基因对细胞迁移和血管生成能力的影响证实该基因参与调控miR-K6-3p诱导内皮细胞迁移与血管生成。进一步，通过Western blot、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)以及GST pull-down实验鉴定与miR-K6-3p靶基因密切相关的信号蛋白及其通路在miR-K6-3p诱导内皮细胞迁移和血管生成中的作用。最后，运用反向遗传学技术在KSHV基因组中剔除miR-K6基因，进一步证实miR-K6-3p及其下游信号通路在内皮细胞迁移与血管生成中的作用。
　　结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒mpCDH-miR-K6-3p构建成功。表型实验结果显示，异位表达miR-K6-3p能够促进内皮细胞迁移和血管生成。质谱分析结果显示，与对照组相比，miR-K6-3p细胞中下调2倍以上的蛋白有47个。经生物信息学分析，筛选出可能包含miR-K6-3p结合位点的3个候选蛋白。荧光素酶报告实验以及Western blot结果表明，miR-K6-3p能够通过直接靶向SH3域结合谷氨酸富含蛋白(SH3 domain binding glutamate richprotein，SH3BGR)的3'非翻译区(untranslated region，UTR)抑制其蛋白表达。过表达SH3BGR能够逆转miR-K6-3p诱导的内皮细胞迁移和血管生成。Co-IP和GST pull-down实验结果显示，miR-K6-3p下调SH3BGR蛋白表达，将其绑定的STAT3释放，使得STAT3被磷酸化活化，活化的STAT3参与调控miR-K6-3p诱导内皮细胞的迁移和血管生成。最后，从KSHV全基因组中剔除miR-K6废除了其对SH3BGR/STAT3通路的调控能力，并且显著抑制了KSHV诱导的细胞迁移和血管生成。
　　结论:miR-K6-3p通过直接靶向抑制SH3BGR蛋白进而激活STAT3信号通路促进内皮细胞迁移与血管生成，从而有助于KSHV诱导的恶性肿瘤的转移与血管生成。

目录

声明

常用缩略词中英文对照

摘要

前言

第一部分 KSHV miR-K6-3p通过靶向SH3BGR促进内皮细胞迁移与血管生成

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 靶向SH3BGR的miR-K6-3p通过激活STAT3信号通路促进内皮细胞迁移与血管生成

引言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 运用反向遗传实验证实miR-K6-3p通过调控SH3BGR／STAT3信号通路促进内皮细胞迁移与血管生成

引言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述1 KSHV编码的microRNAs在KSHV潜伏感染以及致病过程中的作用

综述2 STAT3信号通路在疱疹病毒生命周期以及致病过程中的作用

附录

攻读学位期间发表的论文

致谢