小鼠干扰素基因刺激因子启动子的克隆鉴定与转录调控机制的初探

摘要

背景:固有免疫反应是机体抵抗病毒感染的第一道防线，在抗病毒免疫过程中具有关键作用。干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)是抗DNA病毒信号通路中重要的接头蛋白，还可作为模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)直接识别cAMP、cGMP等参与抗胞内菌感染，此外STING还参与抗RNA病毒的免疫，并在抗肿瘤免疫及自身免疫性疾病中均具有重要的作用。目前对STING的研究主要集中在其活化下游激酶TANK结合激酶1(TANK binding kinase1，TBK1)和干扰素刺激因子3(InterferonRegulatory Factor3，IRF3)的分子机制及其在不同病原体诱导宿主产生固有免疫应答过程中的功能。而STING在进化上高度保守，人源性的STING和鼠源性的STING具有很高的同源性，因此小鼠常被作为STING功能研究中重要的动物模型，但两者仍因种属的特异性在某些方面仍存在差异。本课题组前期对人源性STING的启动子进行了相关研究，目前尚无对小鼠STING基因启动子方面的研究。因此，本课题主要针对小鼠STING基因启动子的特征和调控机制进行研究。
　　目的:寻找并克隆鉴定小鼠干扰素基因刺激因子(STING)的启动子区及其启动子核心功能区域，并进一步鉴定调控小鼠STING基因启动子基本转录活性的关键转录因子，为揭示小鼠STING基因的表达调控机制及种属特异性奠定基础。
　　方法:通过生物信息数据库预测启动子位置，以NIH3T3细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增获取小鼠STING5'上游的启动子区序列(1005nt，-828～+177)，将此核酸序列亚克隆至无启动子活性的pGL3-Basic载体的多克隆位点，构建荧光素酶重组报告质粒。将构建的重组报告质粒瞬时转染NIH3T3细胞及HEK293细胞，使用荧光素酶报告基因检测系统检测其荧光素酶活性，鉴定其是否具有启动子活性。利用步移缺失突变分析法对STING基因启动子5'端进行缺失突变，分别亚克隆到pGL3-Basic载体上，瞬时转染细胞后检测各截短片段的荧光素酶活性，比较相对荧光素酶活性(RLU)后定位STING基因启动子的核心功能区域。利用生物信息学软件分析核心启动子区并预测潜在的转录因子结合位点，进一步利用定点突变技术、si-RNA干扰及基因过表达技术、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)等实验方法，分析转录因子对小鼠STING启动子活性的影响及其作用机制。
　　结果:经双酶切、基因测序鉴定，成功克隆并构建了含有小鼠STING启动子区序列的荧光素酶重组报告质粒pSTING-1005。荧光素酶活性实验结果显示，与载体pGL3-Basic比较，小鼠STING启动子重组报告质粒在NIH3T3细胞及HEK293细胞中均表现出明显的启动子活性。进一步分析STING基因5'端缺失的截短片段的荧光素酶活性后发现，STING基因的核心启动子区域位于-77～+177nt之间。利用生物信息学软件对小鼠STING基因核心启动子区域进行预测，该区域内包含了GATA1、Sp1/Sp3、STAT和IK2等转录因子结合位点。将潜在的转录因子结合位点的关键性碱基进行定点突变，实验结果表明转录因子GATA1和Sp1/Sp3结合位点对维持小鼠STING基因的基本转录活性具有重要作用。同时利用si-RNA干扰及基因过表达实验进一步证实了GATA1和Sp3可以调控STING基因启动子活性，从而影响其翻译和表达。ChIP实验结果进一步证明了转录因子GATA1和Sp3可以与小鼠STING基因启动子直接结合。
　　结论:克隆并成功构建了小鼠STING基因启动子的荧光素酶重组报告质粒，通过截短突变确定其核心启动子区域位于转录起始位点-77至+177nt内，转录因子GATA1和Sp3可正向调控小鼠STING基因启动子的活性。ChIP实验结果进一步证明了转录因子GATA1和Sp3对STING基因启动子的作用是通过与STING的启动子区特定的核酸序列直接结合而实现。

目录

声明

常用缩略词中英文对照

摘要

前言

第一部分 小鼠STING基因核心启动子的鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 小鼠STING基因核心启动子调控机制的初步研究

引言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

附录

综述 cGAS-STING信号通路在监测胞质DNA中的作用

攻读学位期间发表的论文

致谢