胰岛素降解酶介导胰岛素抵抗所致2型糖尿病轻度认知功能障碍的机制研究

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 IDE与胰岛素抵抗和糖尿病MCI的相关性研究
　　目的:
　　研究IDE与胰岛素抵抗、2型糖尿病MCI的相关关系，探讨IDE对2型糖尿病MCI发生的预测价值。
　　方法:
　　本研究共招募239位2型糖尿病患者，根据MoCA得分将其分为MCI组和认知功能正常组。所有受试者入组后于次日早晨7点空腹抽取静脉血，测定空腹血糖、空腹C肽、糖化血红蛋白、肝肾功能、血脂全套，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。用多维度量表评估受试者的认知功能，用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法检测IDE rs4646958基因多态性，并用酶联免疫吸附法测定血清IDE浓度。
　　结果:
　　纳入的2型糖尿病患者中，132人符合MCI的诊断标准，107人是与之相匹配的认知功能正常组。结果表明:1、与认知功能正常组比较，2型糖尿病MCI组患者的血清IDE显著降低(P＜0.001)，HOMA-IR显著升高(P＜0.001);2、在2型糖尿病MCI患者中，血清IDE水平和MoCA得分呈显著正相关(r=0.827;P＜0.001)，HOMA-IR和MoCA得分呈显著负相关（r=-0.644;P＜0.001）;3、在所有2型糖尿病患者中做的相关分析表明，血清IDE水平和MoCA得分（r=0.798;P＜0.001）呈正相关，和HOMA-IR（r=-0.586;P＜0.001）、连线试验A（r=-0.464;P＜0.001）、连线试验B（r=-0.399;P＜0.001）、空腹血糖（r=-0.409;P＜0.001）、糖化血红蛋白（r=-0.237;P=0.015）及平均血糖波动幅度（r=-0.502;P＜0.001）呈负相关;4、回归分析显示，调整了年龄、性别、受教育年限、肝肾功能和血脂水平后，IDE(P=0.001)、糖化血红蛋白(P=0.024)、空腹C肽(P＜0.001)是2型糖尿病发生MCI的影响因素;5、IDE rs4646958基因型在2型糖尿病认知障碍组及认知功能正常组均未发现统计学差异。
　　结论:
　　IDE参与胰岛素抵抗相关的2型糖尿病早期认知功能障碍（特别是执行功能），可能成为早期的预测指标。IDE rs4646958基因多态性在2型糖尿病认知障碍中并未发现显著统计学结果，需要大规模样本进一步明确其在易感人群中的预测价值。
　　第二部分 IDE参与KKAy小鼠认知功能障碍的机制及PPARγ激动剂的干预效应
　　目的:
　　从动物水平上探讨IDE保护动物认知功能的可能机制及其与Aβ水平的相关性，以及PPARγ激动剂在胰岛素抵抗介导的2型糖尿病小鼠认知功能损伤的预防和治疗效果。
　　方法:
　　本研究采用高脂喂养KKAy小鼠作为2型糖尿病轻度认知功能障碍模型，罗格列酮作为PPARγ激动剂对小鼠进行预防和干预。选取6周龄清洁级健康雄性KKAy小鼠和其对应的C57BL/6j(C57)小鼠（均购于中国医学科学院实验动物所），适应性喂养一周。其中随机选出三组KKAy小鼠在8周龄时分别给予低、中、高剂量罗格列酮预防，其他三组在小鼠15周龄出现认知障碍时给予罗格列酮低、中、高剂量干预，还有一组作为2型糖尿病未干预的对照组。将罗格列酮溶于0.9％生理盐水中配置成所需浓度的混悬液，低剂量组每天予1 mg/（kg·d）灌胃，中剂量组每天予3.3 mg/（kg·d）灌胃，高剂量组每天予10 mg/（kg·d）灌胃，糖尿病对照组及正常组C57小鼠予等剂量生理盐水灌胃3个月。处理后进行以下检测:1、每周监测小鼠体质量、空腹血糖及空腹胰岛素水平，计算出相关的胰岛素抵抗指数;2、通过水迷宫及避暗实验观察小鼠的行为学变化;3、Western及RT-PCR法测定小鼠海马PPARγ、IDE的mRNA及蛋白水平;4、对脑组织切片进行HE染色、尼氏染色，镜下观察各组小鼠大脑组织神经元形态、尼氏体的改变;5、免疫化学法测定小鼠脑组织PPARγ、IDE、Aβ的表达。
　　结果:
　　1、各组小鼠体质量、空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数水平的比较:各周龄KKAy小鼠的体质量、空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗水平均高于对照组C57小鼠（P＜0.05），和模型对照组相比，罗格列酮预防和干预组的体质量均无显著统计学差异(P＞0.05)，空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗水平显著下降(P＜0.05)，高剂量效果更为显著。
　　2、各组小鼠行为学比较:水迷宫实验结果表明，与正常对照组相比，模型对照组小鼠逃避潜伏期显著延长，穿台次数显著减少(P＜0.05);与模型对照组小鼠相比，罗格列酮干预和预防组小鼠逃避潜伏期显著减少，穿台次数显著延长(P＜0.05)。避暗实验结果表明，和正常对照组小鼠相比，模型组小鼠避暗潜伏期显著缩短，错误次数显著增加(P＜0.05)，罗格列酮低预防和干预后，潜伏期和错误次数均有显著改善(P＜0.05)，高剂量的效果尤其显著。
　　3、海马组织PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平:模型对照组小鼠海马内PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平显著下降(P＜0.05)，经罗格列酮预防和干预后PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平均显著增加(P＜0.05)，高剂量的效果尤其显著。
　　4、各组小鼠神经元形态的改变:
　　HE染色:正常对照组小鼠海马组织中，神经元细胞形态结构未见显著异常，细胞核形状呈圆形，细胞结构层次清楚且排列整齐。模型对照组小鼠海马组织的部分细胞出现形态结构的破坏，细胞核皱缩，边缘模糊，细胞结构排列松散，有变形甚至坏死。罗格列酮预防和干预后，小鼠海马组织的细胞形态结构的破坏程度有所减轻，排列松散情况好转，神经元的变性坏死程度减轻，病理损伤有所好转。
　　尼氏染色:正常对照组小鼠海马神经元未见显著异常，胞核膜和核仁较清楚;模型对照组小鼠的海马、额叶皮质的细胞排列疏散、细胞间隙较宽，胞浆内Nissl体较少。罗格列酮预防和干预组小鼠与模型组小鼠比较，组织结构有所改善，神经元细胞排列密集、整齐，胞浆中Nissl体增加。
　　5、免疫化学法测定小鼠脑组织PPARγ、IDE、Aβ的表达:正常组小鼠海马组织细胞排列紧密，胞体小，Aβ蛋白着色较浅，表达较弱。模型对照组小鼠海马组织细胞排列疏松，胞体较大，Aβ着色深，表达呈强阳性，PPARγ及IDE的IOD值显著减少(P＜0.05)。罗格列酮预防和干预组小鼠PPARγ及DE的IOD值显著增加，Aβ蛋白显著减少(P＜0.05)。
　　结论:
　　IDE参与胰岛素抵抗所致的糖尿病早期认知障碍，对认知功能起到保护作用。PPARγ激动剂可能是通过升高IDE和降低Aβ水平来预防和改善KKAy小鼠的认知功能障碍的。
　　第三部分 IDE介导的PPARγ激动剂对PC12细胞APP和Aβ的影响
　　前期实验证实PPARγ激动剂可能是通过升高IDE和降低Aβ水平来预防和改善KKAy小鼠的认知功能障碍的。但在细胞水平，PPARγ激动剂对神经细胞的保护作用机制尚未明确。
　　目的:
　　研究IDE介导的PPARγ激动剂对PC12细胞淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ的影响，探讨PPARγ激动剂神经保护作用可能的潜在机制。
　　方法:
　　选取未分化的PC12细胞株，以神经生长因子诱导为神经元细胞。预试验采用10μmol/L的罗格列酮、20μmol/L的氯喹、12.5μmol/L的T0070907分别处理后，处理组和对照组相比具有显著的统计学差异，后续的实验就用该浓度作为理想浓度来处理PC12细胞。在细胞稳定生长24小时后随机分为六组:正常对照组、罗格列酮干预组、T0070907处理组、T0070907预处理+罗格列酮组、氯喹处理组、氯喹预处理+罗格列酮组，每个组设6个平行复孔。干预处理后收集各组相应时间点的细胞，用RT-PCR以及Westernblotting分别检测PPARγ、IDE、APP等指标mRNA和蛋白的表达水平;用ELISA法检测细胞培养液上清液Aβ水平。
　　结果:
　　结果显示:1、和正常对照组相比，罗格列酮干预组的PPARγ和IDE的mRNA和蛋白含量显著增加(P＜0.05)，APP的mRNA和蛋白含量显著减少(P＜0.05);2、单独用T0070907处理组和用T0070907与罗格列酮联合处理组相比，PPARγ、IDE和APP的mRNA和蛋白含量未见显著统计学差异(P＞0.05);3、和氯喹处理组相比，用氯喹与罗格列酮联合处理组PPARγ的mRNA和蛋白含量显著升高，IDE和APP的mRNA和蛋白含量未见显著统计学差异(P＞0.05);4、和正常对照组相比，罗格列酮干预组的PPARγ和IDE的培养液上清液的Aβ含量显著减少(P＜0.05)，其他各组培养液上清液的Aβ含量未见显著统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　PPARγ激动剂可诱导IDE的表达，从而促进APP和Aβ的降解。但是，PPARγ激动剂对IDE诱导的神经细胞损伤的保护作用，均可被PPARγ抑制剂T0070907及IDE抑制剂氯喹所拮抗，表明PPARγ激动剂的神经细胞损伤的保护机制是通过PPARγ激活IDE途径参与调节的。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 IDE与胰岛素抵抗和糖尿病MCI的相关性研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

第二部分 IDE参与KKAy小鼠认知功能障碍的机制及PPARγ激动剂的干预效应

前言

1．材料与方法

2、结果

3．讨论

4．结论

参考文献

第三部分 IDE介导的PPARγ激动剂对PC12细胞APP和Aβ的影响

前言

1．材料与方法

2、结果

3．讨论

4．结论

参考文献

文献综述(一) 胰岛素、胰岛素降解酶、β-淀粉样蛋白在AD中的作用

文献综述(二) 阿尔茨海默病和2型糖尿病共同的酶治疗靶点

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