国产进口两种试剂检测不同基因型HBV DNA结果比较与两种不同HBV基因型检测方法比较

摘要

全球约3.5亿人被感染慢性乙型肝炎病毒，慢性乙型肝炎易引起肝硬化及肝癌，严重威胁人类健康。慢性乙型肝炎的治疗对肝硬化及肝癌的防治具有重要意义。以前对乙型肝炎的诊断及病情检测多使用生化学免疫学指标，近年来分子生物学技术也广泛应用于乙型肝炎的临床诊疗，如乙型肝炎病毒核酸定量检测和乙型肝炎病毒基因分型检测。目前乙型肝炎病毒定量检测多使用实时荧光PCR方法，其对于慢性乙型肝炎患者的诊断、患者治疗时机的决定以及治疗中治疗后疗效的评估及预后判断具有重要意义。本课题旨在针对不同HBV分型，比较某国产实时荧光定量PCR(FQ-PCR)试剂与罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan(CAP/CTM)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的结果，找出国产试剂与进口试剂在敏感度、特异度方面的差距，为提高国产试剂性能打下理论基础。本研究还使用sanger双脱氧测序法(HBV基因分型的金标准)商品试剂盒和基于sanger双脱氧测序法自设计实验体系对反向杂交芯片法进行了验证，以研究此方法可靠性如何，是否可用于临床HBV病毒分型检测。
　　本文研究内容如下:
　　(1)抽取72份慢性乙型肝炎血清标本，采用COBAS Amplicor的FQ-PCR试剂(A)和国产实时FQ-PCR试剂(B)对血清标本进行HBV-DNA对比检测，分析针对不同HBV分型样本时，使用COBAS Amplicor检测结果来评价国产试剂的敏感度、特异度及与试剂A的相关性。结果:A、B两种试剂检测结果总体相关性良好(r=0.94)，定量检测结果差异无统计学意义(P＞0.05)。A、B两种试剂检测低载量样本时，相关系数较低(r=0.31)，B试剂在检测低载量样本时可靠度较差。A、B两试剂检测不同基因型别样本结果相关性较好(r＞0.85)，结果差异有统计学意义。
　　(2)对所抽取72份HBV病毒血清样本进行HBV分型（反向斑点杂交芯片法），再从72份样本中随机选取部分（20个样品）分别用sanger测序法商品试剂盒体系和自设计实验体系进行双重验证，研究两种病毒基因分型方法差异，并在NCBI上进行分型比对。结果:PCR反向斑点杂交芯片法与sanger双脱氧测序法检测相符率高，可用于临床HBV病毒分型检测。
　　(3)根据上述实验结果分析讨论并总结进口国产两种检测试剂主要差异在于检测低载量样本时国产试剂（试剂B）可靠度低于进口试剂（试剂A），国产试剂（试剂B）在检测两例病毒载量＜104IU/mL样本时发生漏检（基因型分别为B型和C/E混合型），实验漏检率为2.7％。
　　(4)为进一步研究HBV病毒分型方法，本论文自设计实验体系检测HBVDNA病毒分型，结果与反向杂交法商品试剂盒和直接测序法商品试剂盒相符率高，成本低，可用于临床检验与科研。
　　结论:由本研究所得结果，建议国产试剂改良核酸提取方法，使用高得率的提取方法（如磁珠法），如有技术条件可尝试研发机械全自动提取设备，并加大PCR整体反应体系，引进内标质控，使用保守区多对结合引物，提高试剂灵敏度可靠性与特异性，就可有望替代进口试剂，降低病人诊疗费用与经济负担。本研究分别用sanger双脱氧测序法商品试剂盒和基于sanger双脱氧测序法自设计实验体系进行双重验证(HBV基因分型的金标准)对反向杂交芯片法进行了验证，总体符合率高，操作简便，特异性强，可用于临床HBV基因型检测。

目录

声明

摘要

英汉缩略词对照表

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 文献回顾

1．2．1 乙型肝炎病毒概况

1．2．2 HBV基因型及其亚型

1．2．3 HBV的感染

1．2．4 HBV的抗病毒治疗

1．2．5 乙型肝炎病毒检测与监控的分子生物学方法

1．3 本课题研究目的及内容

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

第二章 两种试剂对血清样本的HBV-DNA的定量检测

2．1 研究内容

2．2 研究对象

2．3 试剂和仪器

2．4 实验过程

2．4．1 国产HBV DNA病毒定量试剂盒操作步骤

2．4．2 罗氏COBAS AmpliPrip／COBAs Taqman(CAP／CTM)操作步骤

2．5 两种HBV-DNA病毒定量试剂检测结果和比较

2．6 统计学分析

2．7 HBV-DNA载量对检测结果的影响

2．8 灵敏度和特异性分析

2．9 讨论

第三章 血清样本的HBV-DNA病毒分型检测

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 采用HBV DNA病毒斑点反向杂交法对血清样本HBV病毒基因分型

3．3．1 样本处理

3．3．2 PCR扩增

3．3．3 PCR产物的纯化

3．3．4 芯片杂交与显色

3．4 采用试剂盒对血清样本HBV病毒基因分型

3．4．1 样本处理和核酸提取

3．4．2．试剂配置

3．4．4 上机进行PCR扩增

3．4．5 PCR产物的酶解

3．4．7 测序产物纯化

3．5 自设计实验体系对血清样本HBV病毒基因分型

3．5．1 样本处理和核酸提取

3．5．2 扩增引物的设计与目的基因的扩增及纯化

3．5．3 测序PCR反应与测序产物的纯化

3．5．4 测序序列的分析

3．6 反向杂交芯片法HBVDNA病毒分型结果和使用测序法的验证结果及讨论

第四章 总结与展望

4．1 论文工作的主要内容和研究成果

4．2 讨论与展望

4．3 结论

参考文献

攻读学位期间发表学术论文目录

致谢