转录因子GATA4通过作用于GNAI3调控牙齿发育

摘要

研究目的： 通过体内观测GATA4条件性敲基因小鼠表型，体外提取人根尖牙乳头干细胞（SCAPs）进行培养来探究GATA4在牙齿发育过程中的作用。 研究方法： 利用基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，建立了神经嵴细胞特异性敲除GATA4基因的小鼠模型。使用Micro-CT和苏木素-伊红（HE）染色对比观测出生前、出生后的GATA4fl/fl及Wnt1-Cre;GATA4fl/fl的小鼠牙齿发育状况；免疫组化用来观测GATA4fl/fl及Wnt1-Cre;GATA4fl/fl小鼠牙齿发育过程中GATA4和各项成骨成牙指标(RUNX2、OSX、OPN、OCN、BMP4)的表达情况，以及根尖牙乳头处细胞的增殖变化。体外通过提取SCAPs，并加以鉴定，继而以慢病毒为载体，通过RNA干扰的方法将SCAPs中的GATA4沉默，验证敲低效率；CCK8实验观测细胞增殖能力；划痕实验观测细胞迁徙能力；对沉默GATA4的SCAPs进行牙向/骨向诱导，碱性磷酸酶（ALP）染色和活性检测以及茜素红染色（ARS）和钙离子浓度检测验证SCAPs牙向/骨向分化能力，Real-time qPCR及Western Blot实验在mRNA及蛋白水平上检测成牙成骨标志物的表达水平；同时以慢病毒为载体，将SCAPs中的GATA4过表达，验证过表达效率,ALP染色和活性检测以及ARS染色和钙离子浓度检测验证SCAPs牙向/骨向分化能力的变化。根据iTRAQ实验筛选，选择差异蛋白GNAI3做进一步机制研究。荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明GATA4与GNAI3相互作用关系。继而对敲低GNAI3表达的SCAPs进行牙向/骨向诱导，ALP和ARS染色验证敲低GNAI3后SCAPs分化能力的改变。 研究结果： 1、体内实验：Micro-CT显示，Wnt1-Cre;GATA4fl/fl小鼠牙根相较于GATA4fl/fl组明显短小。同时组织学观测证明出生后1d、14d Wnt1-Cre;GATA4fl/fl小鼠牙齿中GATA4表达情况和成骨成牙指标RUNX2、OSX、OPN、OCN、BMP4均较GATA4fl/fl组降低，同时根尖牙乳头处细胞增殖指标PCNA相较于对照组明显减少。 2、体外实验：SCAPs慢病毒转染敲低GATA4表达后，CCK8实验表明SCAPs的增殖能力明显降低；划痕实验表明SCAPs的迁徙能力下降；通过Real-time qPCR及Western Blot证明，当GATA4敲低后，成骨成牙指标RUNX2、OSX、OPN、OCN、DSPP、BSP、BMP4的表达在mRNA及蛋白水平上均明显降低。对敲低GATA4表达的SCAPs进行牙向/骨向分化诱导，ALP和ARS染色验证敲低GATA4后SCAPs分化能力降低。SCAPs慢病毒转染过表达GATA4表达后，SCAPs分化能力升高。 3、依据前期的iTRAQ实验结果，筛选出GNAI3这个差异蛋白，体内体外的实验结果证明在GATA4敲除或敲低之后，GNAI3在牙齿组织以及SCAPs中的表达是降低的。同时荧光素酶报告实验和ChIP实验进一步说明了GATA4结合于GNAI3启动子区域，调控其转录活动。对敲低GNAI3表达的SCAPs进行牙向/骨向诱导，ALP和ARS染色验证敲低GNAI3后SCAPs分化能力降低。 研究结论： GATA4通过调控GNAI3的表达，继而参与牙齿牙根发育的调控。

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