HMGB-1-TLR4-MMP-9信号通路轴介导的神经炎症参与糖尿病眼病的实验研究

摘要

背景：糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种常见的糖尿病慢性微血管并发症，也是糖尿病患者致盲的重要原因。其病理表现为：视网膜细胞凋亡，视网膜神经功能紊乱，新生血管的大量生成。尽管目前已由大量关于DR的假说被报道，但是DR确切的机制至今仍是尚不清楚的。 研究表明，炎症参与视网膜病变的过程，并且视网膜muller细胞和小胶质细胞参与DR疾病的发展过程。视网膜muller细胞和小胶质细胞是参与炎症过程的关键因素。基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质，是一种在细胞外发挥作用的蛋白水解酶，它不仅介导了一系列正常的生理过程，而且在细胞中保持着稳态，特别是基质金属蛋白酶-9，参与血视网膜屏障（BRB）的破坏。原花青素，一种临床上已经使用的安全有效的天然产物，对视网膜muller细胞和小胶质细胞有强大的免疫调节作用。我们认为原花青素可以抑制高糖刺激导致的视网膜muller细胞和小胶质细胞的MMP-9上升，并且探索原花青素可能的抗炎机制。 第一部分 高糖通过DAMPs-TLR-4-NFκB途径促进MMP-9活性的上升导致视网膜病变 目的：研究MMP-9引起糖尿病视网膜病变的机制。 方法：高糖刺激视网膜muller细胞，建立糖尿病视网膜病变模型；腹腔注射链脲做菌（STZ）素建立小鼠糖尿病模型；用明胶酶谱来检测MMP-9的活性变化情况；用免疫蛋白印记法检测信号通路中蛋白质表达水平的变化；用P65NF-κB抑制剂和P38抑制剂来检测逆转炎症的情况；用HE染色观察小鼠视网膜形态结构的改变。 结果：在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，MMP-9激活，STZ可以诱导小鼠糖尿病视网膜形态结构的改变。高糖能够引起视网膜muller细胞MMP-9的激活，这种上升可以被Toll样受体4（TLR-4）抑制剂，p38丝裂素活化蛋白激酶（MAPK P38）抑制剂，核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂所消除。TLR-4抑制剂能减少高糖诱导的视网膜muller细胞P38磷酸化水平。同时，高糖可以引起p-AMPK、p-AKT、p-ERK水平的升高。 结论：高糖通过激活HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路引起视网膜muller细胞和小胶质细胞MMP-9的激活，进而破坏BRB，引起DR。 第二部分 原花青素通过抑制MMP-9来缓解糖尿病视网膜病变 目的：研究原花青素对糖尿病引起的视网膜病变的保护机制。 方法：高糖刺激视网膜muller细胞，建立糖尿病视网膜病变模型；腹腔注射链脲做菌（STZ）素建立小鼠糖尿病模型；用明胶酶谱来检测MMP-9的活性变化情况；用免疫蛋白印记法检测信号通路中蛋白质表达水平的变化；P65免疫荧光检测NF-κB核转录情况。 结果：原花青素能通过抑制视网膜muller细胞MMP-9的表达来缓解高糖引起的视网膜病变。在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，原花青素可以减少MMP-9激活。原花青素能抑制高糖刺激视网膜muller细胞诱导的HSP70、HMGB1的表达。原花青素能抑制高糖刺激视网膜muller细胞诱导的p-AMPK、p-AKT、p-ERK的激活。用原花青素进行体外孵育，能剂量依赖性抑制MMP-9活性。原花青素通过抑制p38-MAPK/NF-κB途径抑制LPS介导的小胶质细胞激活。 结论：原花青素通过抑制p-AMPK、p-AKT、p-ERK的激活以及抑制p38-MAPK/NF-κB信号通路抑制MMP-9的激活，缓解DR。

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