MspA蛋白纳米孔在硅基上的组装和测试

摘要

纳米孔在最近二十多年作为一种单分子检测与表征的有力方法而受到广泛关注。传统的纳米孔平台包括生物纳米孔和固态纳米孔，生物纳米孔主要使用一些拥有用于测序的狭窄限制区的生物孔道蛋白，例如α-溶血素、MspA、AeL等；而固态纳米孔主要通过离子束刻蚀、阳极氧化等方法在薄膜材料上制备。然而这两种平台仍然存在一些限制，对于生物纳米孔，其孔道蛋白孔径唯一，无法随意控制，且磷脂膜稳定性易受外界环境条件的影响。对于固态纳米孔，相较于生物纳米孔，并没有其检测信号时较低的噪声。 为结合固态纳米孔和生物纳米孔各自的优势并对其劣势进行规避，复合纳米孔平台被研究者所提出。本论文主要对囊泡法铺设的磷脂膜在氮化硅纳米孔表面形成半固定结构的稳定性和流动性进行探究，并利用刷膜法搭建了一种新型的复合纳米孔平台，在氮化硅固态纳米孔阵列表面铺设磷脂膜并插入诱变后的M3型MspA蛋白，并对该平台进行检测。主要研究内容如下： 1.固态纳米孔阵列的制备 以实验室自主设计结构的氮化硅自支撑薄膜芯片为加工材料，利用双束型聚焦离子束（DB-FIB）的circle模式加工固态纳米孔阵列，制备孔径为90nm、120nm和150nm的固态纳米孔阵列。在加工过程中发现，在确定预设直径之后，在一定的离子束轰击时间内，加工的纳米孔直径与加工时间成正相关；超过该时间范围后，纳米孔直径随轰击时间变化并不明显。该发现说明离子束加工纳米孔时由于束斑精度较高，虽然离子剂量可以随轰击时间增加，但是可溅射范围有限。 2.囊泡法构建跨孔膜及测试 利用囊泡法在氮化硅纳米孔阵列表面铺设跨孔膜，并在制备囊泡的磷脂DOPC中掺入一定比例带有羧基的磷脂DOPE;在氮化硅表面修饰氨基，从而通过脱水缩合反应形成酰胺键，达到半固定的效果；随后，利用荧光漂白恢复（FRAP）对比了四种磷脂配比的膜的流动性，包括DOPC、DOPE、DOPC∶DOPE=100∶1N/P以及DOPE加入活化剂；并用膜片钳检测其膜电阻实时变化，大于1.0GΩ为保证孔道蛋白正常工作的有效电阻的标准，对比四种磷脂配比的膜的有效持续时间。其中，通过FRAP所测参数代入公式计算可以得出DOPC的流动性最高，而引入尾部带有羧基的DOPE磷脂后，膜的流动性降低，加入活化剂后，膜的流动性最低；通过膜片钳检测，我们发现加入活化剂后的DOPE磷脂形成的跨孔膜的有效持续时间最长。该结果说明在引入酰胺键形成半固定效果后，可以提升磷脂膜的稳定性，但同时也降低了膜的流动性。 3.刷膜法搭建复合孔及测试 以氮化硅纳米孔阵列芯片作为基底材料，通过实验室自主设计的特氟龙流体，搭建复合孔平台。首先，我们对芯片进行了全氟硅烷疏水化处理和表征，并将其装配于特氟龙流体中，确保纳米孔为两侧腔室离子溶液交换的唯一通道；随后，利用刷膜法铺设跨孔磷脂膜，插入M3突变型MspA蛋白，检测形成单一通道的特征电流信号。通过DNA样品的易位信号检测，发现该平台与生物纳米孔信号特征相似；同时我们对比了在不同孔径纳米孔阵列上的膜的有效持续时间，当孔径减小时，磷脂膜的有效持续时间延长。该复合孔平台拥有接近MspA生物纳米孔的测序精度，并且降低样品易位速率，并提高了磷脂膜的有效持续时间。

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