牛新孢子虫与牛瑟氏泰勒虫多重PCR检测方法的建立

摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛体内引起的一种血液原虫病。牛新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora Caninum)或类新孢子虫(Neosporalike)寄生于牛体内所引起的一种原虫病。 本研究首先利用DNASIS软件分别对Kawazu等根据瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计的引物和GenBank登录的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5序列设计的引物进行二聚体化、同源性和互补性分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体和避免具有较高的同源性和互补性。同时在已建立的牛瑟氏泰勒虫和牛新孢子虫常规PCR的基础上，优化引物浓度，Mgcl<,2>浓度，dNTP浓度，循环次数等反应条件后，建立了检测牛瑟氏泰勒虫和牛新孢子虫的多重PCR。 本体系特异扩增片段理论大小分别为：瑟氏泰勒虫864bp，新孢子虫338bp。体系优化的结果为：最佳引物浓度瑟氏泰勒虫为0.2pmol/mL，新孢子虫0.2pmol/mL；dNTP最佳浓度为1.6mmol/L；多重PCR的最佳反应模式为94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min的循环，共30个循环，然后经72℃10min延伸，最后4℃7min结束PCR扩增。用优化后的PCR扩增体系扩增出与实验设计相符的864bp和338bp特异性电泳带。敏感性试验结果表明，该多重PCR可以检测到16fg/mL瑟氏泰勒虫和18pg/mL新孢子虫的核酸模板；用感染牛附红细胞体的抗凝血、牛新孢子虫虫体、感染牛瑟氏泰勒虫的抗凝血、刚地弓形虫虫体、牛魏氏梭菌、牛副结核杆菌、牛大肠杆菌的DNA进行多重PCR扩增，以确定该多重PCR的特异性，结果新孢子虫和瑟氏泰勒虫均扩增出与试验设计的大小一致的核酸片段；而对照的病原体未扩增出任何核酸片段；将用常规PCR检测呈新孢子虫阳性牛的病料和常规PCR检测呈瑟氏泰勒虫阳性牛的抗凝血进行多重PCR扩增，结果多重PCR的检测结果与常规PCR的检测结果符合率为100％。以上结果说明本试验建立的多重PCR方法具有特异、敏感、快速的优点，适于牛瑟氏泰勒虫和牛新孢子虫发病牛群的诊断和感染监测。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

一、牛新孢子虫病

二、牛瑟氏泰勒虫

三、本课题研究的目的和意义

材料与方法

1材料

1.1被检材料采集

1.2 DNA提取所需材料

1.3 PCR扩增及相关所需材料

1.4特异性试验所需材料

1.5主要仪器

2方法

2.1血液涂片检查

2.2 DNA的提取

2.3引物的设计与合成

2.4 PCR扩增体系

2.5 PCR产物的鉴定

2.6多重PCR扩增条件的优化

2.7退火温度的筛选

2.8多重PCR的特异性试验

2.9多重PCR的敏感性试验

2.10多重PCR的应用及符合性试验

结果

1血液涂片结果

2多重PCR优化后的扩增结果

3退火温度的筛选

4特异性试验

5敏感性试验

6多重PCR的应用性试验

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介