冷冻保存对延边黄牛体细胞培养及核移植效率的影响

摘要

本实验对延边黄牛耳皮肤成纤维细胞冷冻保存及作为核移植供体细胞对重组胚发育的影响进行了研究。实验以延边黄牛耳皮肤成纤维细胞培养、冷冻保存为基础，使用了组织块法和酶法结合，成功的培养出了延边黄牛耳皮肤成纤维细胞系，对培养的细胞进行冷冻保存，并观察其解冻后细胞的生长情况，探索出最佳的冷冻保存体系。并将冷冻解冻后的成纤维细胞作为核供体，进行体细胞核移植。结果表明：
　　1.通过组织块法+酶法培养，获得了延边黄牛成纤维细胞系。进行冷冻的组织块在解冻后同样能培养出细胞。与未冷冻组织比较，活组织块数目减少，冻存组织的细胞游离及贴壁时间增加；
　　2.冷冻复苏后的延边黄牛成纤维细胞，在复苏后2～4h即开始贴壁，24h大部分细胞已经贴壁，贴壁率可达到76％。解冻后细胞培养传代2～3代后，细胞的生长速度和形态与冻存前无太大差异；
　　3．细胞冻存试验中，以甘油、DMSO和乙二醇为冷冻保护剂，添加20%血清的DMEM为基础液，得到最适合实验操作的冷冻保护剂为甘油浓度10%，能满足延边黄牛耳皮肤成纤维细胞长期保存的需要；
　　4．从生长曲线可以看出，以低糖DMEM培养的冷冻后延边黄牛耳皮肤成纤维细胞，传代后滞留期短，约1～2天，之后为对数生长期，持续六天左右，第7天达到高峰，第8天细胞接触抑制出现死亡，细胞数量开始减少，进入平台期，冻存后细胞的生长规律与未进行冷冻细胞的基本一致；
　　5.实验对冷冻前后的延边黄牛皮肤成纤维细胞作了染色体检查，结果表明：冷冻后的细胞仍然保留着染色体数目的完整性，染色体数目为2n=60；
　　6.进行体细胞克隆时，采用血清饥饿法和生长抑制法处理供体细胞，结果表明血清饥饿组的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组和生长抑制组。（P<0.05），说明血清饥饿法更适合用于对供核细胞的处理；
　　7．分别使用冷冻前后第5～10代和第11～15代延边黄牛耳皮肤成纤维细胞进行供核，结果表明卵裂率未冷冻组显著高于冷冻组（P﹤0.05），囊胚发育率，未冷冻组显著高于冷冻组（P﹤0.05）。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 动物细胞体外培养

1.2 细胞周期的调控

1.3 细胞的冷冻保存

1.4细胞培养技术在生物学、胚胎学和药学方面的应用

1.5 动物克隆技术

1.6实验的目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3 实验结果的判定

第三章 结果与分析

3.1 冷冻保存对组织块贴壁效率的影响

3.2 解冻后细胞贴壁率

3.3 冷冻解冻后培养细胞的生长曲线

3.4 冷冻解冻后的成纤维细胞染色体形态

3.5供体细胞不同处理方式对核移植胚胎发育的影响

3.6 冻存后不同代数的成纤维细胞供核对核移植胚胎体外发育的影响

第四章 讨论

4.1冷冻组织的细胞培养

4.2延边黄牛皮肤成纤维细胞生长特性

4.3 延边黄牛成纤维细胞冷冻后染色体核型

4.4延边黄牛耳皮肤成纤维细胞冷冻保存

4.5供体细胞不同处理方式对其核移植效率的影响

4.6 冷冻前后不同代数的成纤维细胞供核对核移植胚胎体外发育的影响

第五章 结论

致谢

参考文献