牛D型产气荚膜梭菌病胶体金免疫层析检测方法的建立及初步应用

摘要

产气荚膜梭菌（Cl.perfringens）是一种梭状芽孢属条件性致病菌，该病广泛分布于自然界，在一定条件下，可引起严重的犊牛肠毒血症,甚至死亡。目前针对该菌导致的疾病尚无免疫胶体金检测方法，因此，本研究目的是运用胶体金免疫层析技术，建立一种快速、灵敏、特异的检测牛D型产气荚膜梭菌病的方法。
　　本试验成功地以Cl.perfringens D型标准株C60-2的菌体抗原用甲醛进行灭活后，加弗氏佐剂免疫青年雄家兔制备兔抗牛D型产气荚膜梭菌多克隆抗体，琼扩检测效价为1:128，经辛酸-硫酸铵法粗提，然后再用 HiTrap Protein G HP亲和层析法纯化后，经 SDS-PAGE分析主要蛋白带只有两条，即重链50 KD，轻链24 KD。以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，用25 nm胶体金标记多克隆抗体制备金标探针，分别以兔抗牛源D型产气荚膜梭菌IgG和羊抗兔IgG作为硝酸纤维素膜上的检测线和质控线，组装胶体金试纸条，并对试纸条的检测效果进行评价。
　　研究结果显示，抗体与胶体金结合的最佳 pH为8.6，用蛋白浓度梯度法测定胶体金结合多克隆抗体最佳结合浓度是30μg/mL。试纸条操作简单，用肉眼15 min内可判定结果，对 D型产气荚膜梭菌抗原具有高度特异性，与其它血清型产气荚膜梭菌标准抗原及其它细菌没有交叉反应。试纸条在4℃保存6个月，其特异性及灵敏度无明显变化。上述结果表明，本研究建立的牛D型产气荚膜梭菌病胶体金免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点，适合用于牛D型产气荚膜梭菌病的现场检测及鉴别诊断。

目录

声明

引言

1 产气荚膜梭菌病研究进展

2 胶体金免疫层析技术的研究进展

3 本课题研究的目的和意义

材 料 与 方 法

1 材 料

2 方 法

结果

1D型产气荚膜梭菌培养

2 兔抗牛源D型产气荚膜梭菌多克隆抗体的制备和鉴定

3 胶体金颗粒的鉴定

4 抗体与胶体金结合的最佳pH确定

5 抗体与胶体金结合的最佳浓度确定

6 试纸的制备

7 试纸条的组装

8 特异性试验

9 敏感性试验

10 试纸条的批内和批间重复试验

11 稳定性试验

12 比较试验

13 临床检测试验

讨论

1 抗原

2 免疫方法及程序

3 抗体IgG的纯化及鉴定

4 胶体金的烧制

5 材料的筛选

6 胶体金的标记

7 试纸条的组装及保存

8 鉴别诊断试纸条的制备

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录（攻读学位期间发表论文目录）