NMDA受体在小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性活动中的作用机制

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 NMDA对小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性简单峰电位的影响
　　目的：
　　N-甲基-D-天冬氨酸受体是离子型谷氨酸受体，它参与神经元突触后反应以及调控突触前神经递质的释放。在中枢神经系统中，它对突触传递的调控起着关键作用。众所周知，NMDA受体在哺乳动物的小脑皮层、颗粒细胞膜、平行纤维以及分子层中间神经元上广泛表达。在离体条件下，NMDA受体的活化增强浦肯野细胞的抑制性突触后电流。然而，在在体条件下，NMDA对小脑神经元的活动影响还不清楚。因此，在我们的实验中，应用电生理膜片钳记录和药理学方法，探索外源性NMDA对乌拉坦麻醉小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性活动的影响，了解NMDA对小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性简单峰电位放电的影响机制。
　　方法：
　　实验选取25只6-8周龄成年ICR小鼠，并对其进行腹腔注射乌拉坦麻醉(1.3g/kg)。待40分钟麻醉结束后，小鼠行气管插管术，使其呼吸道保持通畅，并将小鼠固定在脑立体定位装置上。在小脑部位制作一个圆形的灌流槽，对小鼠小脑蚓部行开颅手术，打孔直径约为1-1.5mm，暴露小脑表面的记录区域，并轻轻地揭掉硬脑膜，使用蠕动泵在小脑表面持续不断地灌流(0.4ml/min)含95％O2和5％CO2的人工脑脊液。用体温维持仪监测使小鼠体温保持在37.0±0.2℃。我们使用Axopatch-200B放大器(Molecular Devices，Foster City,CA)对浦肯野细胞进行贴附式记录。通过D/A转换器1440和Clampex10.3数据采集软件获得浦肯野细胞自发性简单峰电位的放电数据。记录的玻璃电极内充入细胞内液，使其刺入人工脑脊液表面阻抗为4-6MΩ。在细胞外记录条件下，通过浦肯野细胞特有的放电模式（即:在规律的简单峰电位放电中夹杂有不规律的复杂峰电位）进行判断。选取100秒时间内的浦肯野细胞自发性放电来计算放电间隔。电生理学数据分析采用Clampfit10.3软件，所有数据采用均数±标准误表示，并应用SPSS21.0软件进行配对T检验或单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果：
　　(1)脑表面灌流NMDA(5-200μM)抑制浦肯野细胞自发性简单峰电位的放电频率，并存在剂量-依存性，其半数抑制浓度为50.3μM。
　　(2)给予GABAA受体拮抗剂SR95531(20μM)，阻断NMDA对浦肯野细胞自发性活动的抑制，并且显示出NMDA诱发的小脑浦肯野细胞兴奋性增高。
　　(3)给予NMDA受体拮抗剂DAP-V(250μM)，对自发性简单峰电位的放电频率没有显著影响，然而浦肯野细胞的自发性简单峰电位放电频率与对照组相比更加规律。
　　(4)此外，NMDA增加了篮状细胞和星状细胞等分子层中间神经元的放电频率。
　　结论：
　　脑表面灌流NMDA兴奋分子层中间神经元并抑制浦肯野细胞的活动，提示分子层中间神经元NMDA受体在调节浦肯野细胞自发性活动以及在信息传输和整合方面发挥着重要的作用。
　　第二部分 NMDA对小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性复杂峰电位的影响
　　目的：
　　在成年小鼠小脑皮层爬行纤维-浦肯野细胞突触后有NMDA受体的表达，爬行纤维-浦肯野细胞突触后的NMDA受体在离体条件下参与其突触传递。然而，在活体小鼠完好的小脑皮层中爬行纤维-浦肯野细胞突触后的NMDA受体的作用还不清楚。因此，本研究拟应用全细胞膜片钳记录和药理学方法，在乌拉坦麻醉下研究小鼠小脑皮层爬行纤维-浦肯野细胞突触后的NMDA受体的功能，其目的在于明确NMDA受体在小鼠小脑皮层自发性复杂峰电位活动中的作用机制。
　　方法：
　　实验选取29只6-8周龄成年ICR小鼠，并对其进行腹腔注射乌拉坦麻醉(1.3g/kg)，待40分钟麻醉结束后，对小鼠行气管插管术，使其呼吸道保持通畅，并将小鼠固定在脑立体定位装置上。在小脑部位制作一个圆形的灌流槽，对小鼠小脑蚓部行开颅手术，打孔直径约为1-1.5mm，暴露小脑表面的记录区域，并轻轻地揭掉硬脑膜，使用蠕动泵在小脑表面持续不断地灌流(0.4ml/min)含95％O2和5％CO2的人工脑脊液。用体温维持仪监测使小鼠体温保持在37.0±0.2℃。我们使用Axopatch-200B放大器(Molecular Devices，Foster City,CA)对浦肯野细胞进行全细胞膜片钳记录。通过D/A转换器1440和Clampex10.3数据采集软件获得浦肯野细胞自发性放电的数据。记录的玻璃电极内充入细胞内液，使其刺入人工脑脊液表面阻抗为4-6MΩ。在全细胞记录模式下，通过浦肯野细胞特有的放电模式（即:在规律的简单峰电位放电中夹杂有不规律的复杂峰电位）进行判断。选取100秒时间内的浦肯野细胞自发性放电来计算放电间隔。电生理学数据分析采用Clampfit10.3软件，所有数据采用均数±标准误表示，并应用SPSS21.0软件进行配对T检验或单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果：
　　(1)在电流钳记录模式下，小脑表面灌流50μM的NMDA增加复杂峰电位诱发简单峰电位放电暂停并伴随其放电频率的降低。
　　(2)在电压钳记录模式下，脑表面灌流50μM的NMDA增强复杂峰电位诱发内向电流的波形，表现为曲线下面积增加和小穗数目增加。NMDA增加自发性复杂峰电位曲线下面积具有明显的浓度依存性，其半数有效浓度为33.4μM。
　　(3)NMDA显著增加复杂峰电位诱发后超级化电流的振幅，半宽以及衰减时间。
　　(4)脑表面灌流NMDA的拮抗剂D-APV250μM，导致自发性复杂峰电位的波形和曲线下面积减小、小穗数目减少以及后超级化振幅减小。
　　结论：
　　爬行纤维-浦肯野细胞突触后的NMDA受体有助于增强复杂峰电位的自发性活动，表明在小脑皮层爬行纤维-浦肯野细胞突触后的NMDA受体在爬行纤维信息传递和整合中起到重要作用。

目录

声明

CONTENTS

英文缩写词表

Chapter 1 Effect of NMDA on spontaneous simple spikes of cerebellar Purkinje cells in vivo in mice

Abstract

摘要

1．1 Introduction

1．2 Materials and Methods

1．2．1 Animals and Anesthesia

1．2．2 Experiment Equipment

1．2．3 Surgical procedures

1．2．4 Electrophysiologicai recordings

1．2．5 Drug administration

1．2．6 Statistical analysis

1．3 Results

1．3．1 Cerebellar surface application of NMDA decreased SS firing of PCs

1．3．2 NMDA reduced PC SS firing via the activation of GABAA receptor

1．3．3 Cerebellar surface application of NMDA evoked the excitation of MLIs

1．4 Discussion

1．4．1 NMDA induced inhibition rather than excitation of cerebellar PCs

1．4．2 NMDA mediated the excitation of cerebeilar MLIs

1．4．3 MLIs play a key rolr in controlling the output of PCs

1．5 Conclusions

References

Chapter 2 Effect of NMDA on spontaneous complex spikes of cerebeilar Purkinje cells in vivo in mice

Abstract

摘要

2．1 Introduction

2．2 Materials and Methods

2．2．1 Animals and Anesthesia

2．2．2 Experiment Equipment

2．2．3 Surgical procedures

2．2．4 Electrophysiological recordings

2．2．5 Drug administration

2．2．6 Statistical analysis

2．3 Results

2．3．1 Effects of NMDA On CS activity of PCs in the cerebellar cortex

2．3．2 NMDA enhanced CS-evoked AHP currents

2．3．3 Blockade of NMDAR attenuated the strength of spontaneous CS

2．3．4 Blockade AMPARs abolished spontaneous CS firing and NMDARs activity

2．4 Discussion

2．5 Conclusions

References

Review NMDA receptor and it’s funcation in cerebellar cortex

Publication

致谢