小白菊内酯介导TLR4-STAT3交叉对话调控肝纤维化进程的研究

摘要

目的:研究小白菊内酯(Parthenolide，PNL)通过介导TLR4-STAT3交叉对话改善肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)活化导致肝纤维化的作用机制。
　　方法:转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)10ng/ml刺激HSCs或者脂多糖(Lippolysaccharide，LPS)1μg/ml刺激小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7，1h后给予PNL(1.56μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM);或给予PNL(12.5μM、25μM)，TLR4抑制剂CLI-095(10μg/ml)，STAT3抑制剂Guggulsterone(25μM)，4h后提取细胞总蛋白和RNA，通过蛋白印迹和RT-PCR方法测定细胞中纤维化指标α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen typeⅠ，Collagen-Ⅰ)等，炎症因子P2X7受体(P2X7r)，半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Cysteine aspartic enzyme-1，Caspase-1）和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等，凋亡基因B淋巴细胞瘤-2基因(B-celllymphoma-2，Bcl-2)等，还有TLR4/JAK2/STAT3和PI3K/Akt/mTOR信号通路中各项指标的蛋白或mRNA表达，并且通过细胞免疫荧光实验作进一步验证。
　　结果:PNL能够显著降低TGF-β刺激后HSCs中纤维化指标α-SMA、Collagen-Ⅰ的表达，并且降低金属蛋白酶组织抑制剂1(Tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP1)与基质金属蛋白酶13(Metal matrix proteinase，MMP13)的比值;PNL还能够降低P2X7r、NLRP3、Caspase-1、IL-6等多种炎症相关因子的表达;PNL抑制Bcl-2等抗凋亡基因，并且增加Caspase-3等促凋亡基因的表达;PNL抑制或下调TLR4/JAK2/STAT3和PI3K/Akt/mTOR信号通路中的多种信号因子。
　　结论:PNL能够促进活化HSCs的凋亡，抑制多种促炎因子的释放，并且通过调节TLR4-STAT3信号通路交叉对话，从而改善肝纤维化。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 实验方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 MTT实验

2．2．3 提取总蛋白

2．2．4 Western Blotting实验

2．2．5 RT-PCR实验

2．2．6 免疫荧光实验

2．3 统计学处理

第三章 实验结果

3．1 PNL对细胞存活率及肝纤维化标志物表达的影响

3．2 PNL对炎症指标表达的影响

3．3 PNL对凋亡指标表达的影响

3．4 PNL对TLR4信号通路蛋白表达的影响

3．5 PNL对JAK2／STAT3信号通路蛋白表达的影响

3．6 PNL对PI3K／Akt／mTOR信号通路蛋白表达的影响

3．7 PNL对TLR4-STAT3交叉对话中多种蛋白表达的影响

3．8 PNL对两种巨噬细胞存活率以及RAW264．7中TLR4-STAT3相关蛋白表达的影响

第四章 讨论

参考文献

致谢