磷酸甘露糖异构酶基因选择标记遗传转化系统的研究

摘要

本论文从克隆甘露糖异构酶基因，构建含有GFP基因的安全选择系统植物表达载体和含有抗病基因的安全选择系统植物表达载体及对杨树的遗传转化等方面对抗病杨树的安全选择标记系统进行了研究，主要的研究内容有以下几个方面：　　1本实验成功的克隆了编码6-磷酸甘露糖异构酶基因，将其作为选择基因，构建到去掉选择标记基因的表达载体pMBIA1301-hyg上，得到可在含有甘露糖的培养基上筛选转化芽的植物表达载体pMBIA1301-manA。　　2由美国Novartis公司赠送的pNOV2819植物表达载体在标记基因启动子的选择上优于本实验室构建的pMBIA1301-manA。本研究利用pNOV2819成功的构建了用于检测甘露糖筛选体系转基因表达量的植物表达载体pNOV2819-GFP，用于抗病的表达载pNOV2819-NP1和pNOV2819-GAFP-NP1，这是首次尝试将双价抗病基因构建到甘露糖安全选择标记基因的植物表达载体上。　　3通过对烟草和杨树甘露糖敏感性测验结果发现：烟草不能用此转化系统进行筛选。杨树可以用并得到较适合的杨树筛选培养基：甘露糖8g/l和蔗糖22g/l。　　4以美洲黑杨X小叶杨优良无性系NL-895杨为受体材料，通过根癌农杆菌EHA105介导进行转化。获得了一批甘露糖筛选后的转基因芽。对其进行荧光检测，证明pNOV2819-GFP已转入杨树中，且转基因分化芽能够在甘露糖培养基上生长。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

前言

一转基因林木的生态安全性

1基因流与转基因逃逸对近缘物种的潜在威胁及对策

2转基因林木对非靶标生物的影响

3标记基因的安全性问题

4解决使用选择标记基因存在的问题的方法有

二绿色荧光蛋白基因

1与其余两种常用报告基因Gus和Luc相比，GFP具有极大的优越性

2 GFP监测转基因植物中选择标记基因的消除中的作用

三甘露糖异构酶基因作为筛选体系

1原理

2 PMI转化系统的影响因素

3安全性评价

第二章材料与方法

1 PMI基因克隆

1.1材料

1.2 方法

2植物表达载体的构建

2.1 材料

2.2 方法

2.3 PMI正选择标记系统表达载体构建路线

2.4 含有报告基因GFP的PMI正选择标记系统表达

2.5 含有抗病基因NP-1的PMI正选择标记系统表达载体的构建

2.6 含有双价抗病基因的PMI正选择标记系统表达载体的构建

3甘露糖异构酶基因筛选系统的初步探讨

3.1 材料

3.2 方法

3.3 绿色荧光蛋白基因的检测

第三章结果与分析

1 PMI(manA)基因克隆

1.1 PMI(manA)基因的扩增结果

1.2 manA基因的克隆结果

2 PMI正选择标记系统表达载体构建

2.1表达载体的选择

2.2 酶切的影响因素

2.3 PCR引物上加酶切位点的构建的相关因素

2.4 中间载体构建过程

3 Positech系统的应用

3.1 含有报告基因GFP的PMI正选择标记系统的构建

4烟草甘露糖筛选的结果

5杨树甘露糖筛选的结果

6杨树叶片的转化

7甘露糖筛选杨树转化芽的GFP检测

第四章结论与讨论

参考文献