杨树抗黑斑病相关基因表达谱分析

摘要

表达序列标签(EST)和基因芯片技术是功能基因组学中常用的高通量研究方法。本研究同时运用这两种高通量技术，从基因表达整体水平研究杨树在黑斑病菌致病过程中的抗病机制，可为杨树抗黑斑病育种提供理论依据。　　本研究对2个杨树叶片cDNA文库随机挑取克隆进行5’端测序，共获得有效EST序列20023条，并递交至GenBank数据库，登录号从CX167465到CX187487。序列经拼接后，获得10816个UniGene，其中3734个Contig，7082个Singletons。8853个具有同源性匹配序列的基因中，按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分三个不同分类角度分类，被赋予功能的基因数累计达21100个。经对所有具有功能的基因研究发现，有两类基因的含量较高，一类是杨树叶片组织特异性相关的基因，另一类是杨树叶片受外界胁迫表达的抗逆相关基因。　　在本实验从3734个Contigs中得到94个碱基替代型侯选SNP，39个插入缺失型侯选SNP。利用SSRFinder软件，从10816条一致性序列中发现713个候选SSR标记，类型达191种。　　EST序列是制备cDNA芯片的良好基因资源，本实验根据EST序列的注释结果，挑取3000个克隆进行了cDNA芯片制备，并利用此cDNA芯片，对黑斑病菌诱导不同时间的杨树叶片进行了基因表达谱分析。结果表明差异表达的基因主要为参与蛋白合成、细胞防卫反应及信号传导等基因。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

前言

1植物抗病分子机制与抗病基因

1.1植物抗病分子机制

1.2植物的抗病基因

1.3抗病基因的信号传导

2 DNA测序技术

2.1 Sanger双脱氧链终止法原理

2.2 DNA测序仪的的产生与发展

2.3 ABI公司的DNA测序技术

3 EST技术及其应用

3.1 EST技术的原理与方法

3.2 EST技术的主要应用

3.3生物信息学在EST研究中的应用

3.4植物基因组研究计划

4基因芯片技术及其在植物研究中的应用

4.1基因芯片简介

4.2基因芯片技术在植物研究中的应用

4.3生物信息学在基因芯片研究中的应用

5本课题研究立题意义与技术路线

5.1立题意义

5.2技术路线

第二章杨树黑斑病菌诱导叶片的大规模EST序列测定

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1大规模质粒DNA提取

2.2 EST测序反应条件优化

2.3大规模EST序列测定

3讨论

3.1 cDNA文库质量

3.2质粒提取

3.3测序条件

第三章杨树抗黑斑病相关基因表达谱分析

1材料与方法

1.1实验分析材料

1.2生物信息学分析

2结果与分析

2.1有效EST序列获得

2.2 EST序列拼接分析

2.3基因表达频率及高丰度表达基因分析

2.4基因表达功能分析

2.5 EST序列递交数据库

2.6 SNP标记开发

2.7 SSR标记开发

2.8受黑斑病菌诱导杨树叶片组织中与植物抗病相关的基因分析

3讨论

3.1 EST序列冗余度及表达基因丰度

3.2杨树黑斑病菌诱导叶片抗病相关基因表达

3.3 EST-SNP及EST-SSR标记开发

第四章利用cDNA芯片检测杨树抗病与感病无性系叶片基因表达谱

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要仪器及试剂

1.3 cDNA芯片克隆制备

1.4总RNA抽提、纯化及质量检测

1.5荧光探针的制备

1.6芯片杂交与洗涤

1.7数据分析

2结果与分析

2.1 cDNA克隆的PCR扩增

2.2杂交检出率及相关性分析

2.3差异基因表达分析

3讨论

3.1芯片结果与EST测序结果的一致性分析

3.2谐调互作与非谐调互作中的应答先后分析

4存在的问题及展望

参考文献