香雪兰体外再生植株和杂种后代遗传、表观遗传多态性及花香成分分析

摘要

对香雪兰3个品种进行了种间杂交的初步研究,共尝试了3个组合,选取14个杂交子代使用 AFLP分子标记技术进行杂种鉴定,根据条带统计结果、聚类分析及主成份分析发现,子代全部是3个香雪兰品种的杂交后代,而且大部分都属于偏母本类型的杂种,子代AFLP扩增结果出现了亲本都没有的DNA条带,说明种间杂交产生了遗传变异。
　　 MSAP(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism)技术检测了香雪兰亲本和杂交后代的甲基化水平,在荷白与荷粉杂交体系中用了16对引物,共产生了711条带,甲基化水平在14.09％-15.77％之间,荷粉与荷黄的杂交体系中,21对引物共扩增出619条带,甲基化水平为11.38％-12.75％,两者都是以内侧胞嘧啶全甲基化为主。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性(Methylation-Sensitive Polymorphism,MSP)和甲基化不敏感多态性(Methylation-Insensitive Polymorphism,MISP),与AFLP一样,对MSAP数据做了聚类和主成份分析,验证了杂种的真实性。
　　 尽管亲本向杂种的DNA甲基化模式的遗传传递主要遵循孟德尔的遗传方式,香雪兰种间杂交仍然可以导致杂种一代发生不同程度的DNA甲基化变异,在荷白与荷粉的杂交后代中,变异率为0.84％,荷粉与荷黄的杂交后代的变异率更低,仅为0.16％,杂种后代与亲本相比,主要表现为甲基化程度的降低。
　　 通过Mantel’s检测,分析了AFLP、MSP和MISP之间的相关性,发现MSP与MISP之间相关性极显著,在荷白和荷粉杂交体系中,AFLP与MSP和MISP之间具有相关性,但是不显著,在荷粉与荷黄的杂交体系中,则没有相关性。
　　 以幼花序和花序轴做为外植体,根据所用激素不同,香雪兰既可以通过直接体细胞胚胎发生途径由周缘细胞直接再生,还可以经过胚性愈伤组织间接再生。在直接体细胞发生途径中,最佳的激素配比是IAA:6-BA=2:1mg/L,幼花序的再生率为84％,花序轴的再生率为100％。在间接体细胞发生途径中,激素比例为6-BA:2,4-D为5:1mg/L时,愈伤组织再生的效率最高,其中幼花序为92.4％,花序轴为100％。当胚性愈伤组织转移到含有2mg/L IAA和3mg/L6-BA的MS培养基上后,可以分化成完整的植株。
　　 AFLP和MSAP两种分子标记技术被用来检测再生植株的遗传和表观遗传稳定性,在直接体细胞再生途径中,20对引物在亲本和11个再生植株中共扩增出916条清晰条带,其中8条表现为多态性,比率为0.87％,在间接体细胞再生途径中,18对引物共扩增出1075条带,其中3条为多态性条带,比率为0.27％,与亲本相比,再生植株变异模式有两种,即再生植株新带的增加和亲本条带的消失。MSAP分析表明,组织培养可以导致 CG和 CNG两种模式的甲基化水平的变异,变异率在直接和间接途径中分别为1.1％和1.3％。
　　 以幼花序为外植体,在N6培养基上可以诱导黄原间接体细胞胚胎发生途径,SDS-PAGE技术检测这一形态发生过程中的可溶性蛋白变化,发现6种多肽与体细胞胚发育有关,分子量为45,53,55kD的多肽存在于胚性愈伤组织、球形胚、和胚芽鞘时期,83kD的多肽则存在于后两个时期,即胚芽鞘期和真叶期胚中,37kD的多肽存在于胚性愈伤组织和球形胚期胚状体中,35kD的多肽存在所有的时期当中。
　　 利用静态顶空的方法收集了6个香雪兰栽培品种及其中两个品种9个正反交F1代的花香成分,经过 GC-MS分析后,共检测到43种花香成分,每个品种的花香成分在3-25个之间,主要成分都仅仅为2-4种,包括异戊二烯类物质和脂肪族衍生物,同时还有少量的含氮和含硫化合物。在所有的成分当中,沉香醇的含量最高,在亲本和子代的花香研究中发现,亲本主要花香成分可以稳定的遗传给后代,此外,研究还发现花瓣和雌蕊是香雪兰花香的主要释放部位。
　　 基于S(o)rensen's相似指数,进行了非度量多维测度分析,结果表明,被测品种可以分为两类,同时本论文还讨论了香雪兰花香在授粉中的作用,主要表现在吸引蝴蝶、娥类和蜜蜂等昆虫方面的作用。

目录

文摘

英文文摘

第一部分香雪兰亲本和F1代遗传和表观遗传多态性分析

引言

1.香雪兰概述

2．AFLP和MSAP分子标记系统

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果分析

1．亲本和杂交后代遗传多态性分析

2．亲本和杂交后代表观遗传多态性分析

讨论

结论

第二部分香雪兰组织培养再生植株遗传和表观遗传稳定性分析及间接体细胞胚胎发生过程中特异蛋白研究

引言

1．香雪兰组织培养

2．植物体细胞克隆变异

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果分析

1．香雪兰组织培养再生植株遗传和表观遗传多态性分析

2．香雪兰间接体细胞胚胎发生特异蛋白的研究

讨论

1．香雪兰组织培养再生植株遗传和表观遗传稳定分析

2．香雪兰间接体细胞胚胎发生特异蛋白的研究

结论

第三部分香雪兰花香成分及遗传模式分析

引言

1．花香综述

2．花香萜类代谢及相关酶和基因

材料与方法：

1实验材料：

2实验方法：

结果分析

1．香雪兰花香成分及遗传模式分析

2．香雪兰花香成分在分类学上的应用

讨论

结论

参考文献

致谢

在学的期间公开发表论文及著作情况