油茶查尔酮合酶和异构酶基因cDNA的鉴定和序列分析

摘要

油茶为山茶属多年生常绿乔木，是我国独有的食用木本油料树种，广泛分布于湖南、江西、广西等17个省(市、自治区)，1100多个县(市)。 黄酮类化合物系色原烷或色原酮的衍生物，是一类在高等植物中大量存在的重要的次生代谢产物。它们有很多重要的功能，例如，参与花色的形成、UV防护、抵抗病原体等等。目前研究表明，它们还与人类的健康有着密切的关系，具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用。查尔酮合成酶是所有黄酮类化合物合成的关键酶，它介导了黄酮类化合物合成的第一步，催化3个分子的丙二酞辅酶A与1个分子对羟基苯丙烯酞辅酶A缩合成袖皮素查尔酮，并以此为支架经由查尔酮异构酶的异构作用使其他黄酮类化合物得以衍生出来。 本项研究以近成熟油茶种子构建的cDNA文库为基础，从中钓取经EST数据初步分析并推断可能是查尔酮合酶基因和查尔酮异构酶基因的5条cDNA序列进行研究，克隆号分别为1080、1279、4211、1216和1249。首先用微量碱裂解法提取5个克隆的质粒DNA，然后进行PCR扩增和测序鉴定。5个克隆均扩增出特异谱带，其中1216号克隆和1249号克隆的扩增片断为1000bp左右，初步判断为查尔酮异构酶基因序列；1080、1279和4211号克隆的推断片断大小依次为860bp、1030bp和1500bp左右，初步判断为查尔酮合酶基因序列或片断。 选择4211号克隆和1216号克隆进行完整序列的测序，结果显示，4211号克隆cDNA全长序列为1523bp，经与核酸数据库进行比对分析，确定为查尔酮合酶基因；该基因编码412个氨基酸，起始密码子为GTG，终止密码子为TAA，是个完整的CDS。经网上比对，发现该cDNA序列比核酸数据库中最长的查尔酮合酶基因cDNA序列还要多69个碱基，是目前世界上发现的最长的查尔酮合酶基因。1216克隆为查尔酮异构酶基因的cDNA，拼接校对后的长度为1002bp，编码206个氨基酸，起始密码子为GTG，终止密码子为TAG，是查尔酮异构酶基因的完整CDS。两个基因克隆现保存在中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室。 本文还对上述两个基因的结构特点、编码氨基酸序列及二级结构进行了初步分析和预测。

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文摘

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1绪论

2油茶查尔酮合酶基因的分子克隆

3油茶查尔酮异构酶基因的分子克隆

4结果与创新点

参考文献

附录A 查尔酮异构酶的缩略表

附录B

附录C

附录D

致谢