曲霉孢子萌发中葡萄糖氧化酶活性电化学检测方法初步研究

摘要

孢子是生物体产生的一种具有繁殖或休眠作用的特殊生命形式，能在恶劣的环境下保持自有的传播能力，并再在有利条件下直接发育成新个体。尽管孢子被认为是代谢惰性的，但它们却是极好的酶贮藏库和非常有前景的生物催化剂，更是生命繁殖的重要阶段，研究孢子萌发中的活性物质变化可为有效利用或控制其活体提供理论基础。常规的研究方法如光度法、色谱法所需仪器庞大、能耗高、昂贵，且不能进行对活体实时、原位研究。电化学方法具有灵敏度高、选择性好、响应快速等特点，扫描电化学显微分析在实现生物体系实时、原位、无损以及在线分析的同时，还可进行微区生物活性成分分析，基于此，我们提出采用电化学方法研究孢子萌发过程中活性成分的新方法及新思路。本文以食品、医药、化工、生物技术等行业中有广泛应用的微生物来源葡萄糖氧化酶(GOx)为研究对象，采用电化学方法研究了曲霉孢子的不同生长阶段的GOx活性，为进一步开发曲霉孢子作为GOx生物催化剂，或作为有害曲霉菌的抑制靶点提供理论依据和技术支撑，具体结果如下:
　　(1)建立定量检测GOx酶活的电化学循环伏安方法。巧妙地引入二茂铁甲醇(Fc)作为氧化还原探针，获取GOx催化反应中的电子传递信号，以玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝电极为对电极，对不同酶浓度的磷酸缓冲溶液，采用循环伏安法进行检测。结果表明，在酶浓度为0.128～2.377 U/mL的范围内，响应峰电流与酶浓度之间具有良好的线性关系，其回归方程为:I[10-5A]=4.427·E[U]+14.054，相关系数为0.998，检测下限为0.128U/mL。采用样品加标法进行回收率实验，回收率在97.208％～104.538％之间。在采用电化学方法的同时采用传统的滴定法测定酶活进行对照，结果表明，循环伏安法检测GOx酶活力准确可靠，且操作更加简便快速。
　　(2)电化学循环伏安法测定黑曲霉孢子萌发过程中GOx酶活。基于上章建立的电化学循环伏安法测定GOx酶活的方法，提出电化学循环伏安法测定黑曲霉孢子中GOx酶活的原理与方法，并将该法应用于测定黑曲霉孢子萌发过程中GOx酶活性的变化，同时采用生物显微镜观察了黑曲霉孢子的生长情况，获得了黑曲霉孢子萌发过程中的GOx酶活变化。结果表明，在96孔板中培养0～4h，孢子还未萌发，孢子的酶活力没有明显变化。在第4～10h，孢子迅速萌发，孢子的GOx酶活力逐渐增强，在第8h达到最高为2.13 U/mL。第10～16h，孢子萌发完全，孢子的GOx酶活力又恢复到最初的水平。同时使用滴定法进行对照实验，结果显示两种方法结果近似。
　　(3)扫描电化学显微镜(SECM)实时监测黄曲霉单孢子萌发过程的形貌和GOx酶活变化。基于循环伏安法检测GOx的原理，结合SECM，实时、在线研究了黄曲霉孢子萌发过程中的形貌与GOx酶活变化。用聚苯乙烯的培养皿固定黄曲霉孢子，以Fc作为氧化还原介质，10μm的铂微电极为探针，银/氯化银为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用SECM技术对单个黄曲霉孢子进行成像，观测黄曲霉孢子从休眠到萌发过程中的形貌，同时检测萌发过程中的GOx活性变化。结果表明，随着孢子萌发，孢子形状变化为由近似圆球到一侧慢慢长出凸起的萌发管的过程。当孢子开始萌发，孢内的GOx复苏，同时孢膜退化，通透性增强，Fc与葡萄糖能够进入孢子内与复苏的GOx进行氧化还原反应，使得探针检测到的孢子中心电流增强。

目录

声明

中英文缩写词对照表

摘要

1 绪论

1．1 葡萄糖氧化酶概述

1．1．1 葡萄糖氧化酶的酶学性质和应用

1．1．2 GOx的来源及生产

1．2 曲霉GOx的研究进展

1．2．1 曲霉生产GOx的相关研究

1．2．2 曲霉孢子GOx活性的研究进展

1．3 GOx酶活测定方法

1．3．1 测压法

1．3．2 滴定法

1．3．3 分光光度法

1．3．4 傅里叶变换红外光谱法

1．3．5 生物传感器法

1．3．6 电化学方法

1．4 电化学技术与方法

1．4．1 循环伏安法

1．4．2 扫描电化学显微镜

1．5 研究目的与意义

1．6 研究内容

2 电化学循环伏安方法定量检测GOx酶活

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 材料

2．2．2 仪器与设备

2．2．3 实验试剂

2．2．4 酶的灭活

2．2．5 电化学方法实验

2．2．6 标准方法对照

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测原理

2．3．3 添加100μL灭活酶的Fc-葡萄糖溶液循环伏安扫描曲线

2．3．4 添加100μL GOx的Fc-葡萄糖溶液循环伏安扫描曲线

2．3．5 添加100μL不同浓度GOx的Fc-葡萄糖溶液循环伏安扫描曲线

2．3．6 标准曲线的绘制

2．3．7 精密度试验

2．3．8 回收率试验

2．3．9 干扰实验

2．3．10 标准方法对照

2．4 本章小结

3 电化学循环伏安法测定黑曲霉孢子萌发过程中GOx酶活

3．1 前言

3．2 材料

3．3 仪器与设备

3．4．1 试剂

3．4．2 培养基配制

3．5 实验方法

3．5．1 黑曲霉孢子种子液的制备

3．5．2 黑曲霉孢子生长过程中的酶活测定

3．5．3 生物显微镜观察

3．5．4 标准方法对照

3．6 结果与讨论

3．6．1 黑曲霉孢子中GOx检测原理

3．6．2 孢子生长过程中萌发观察

3．6．3 孢子生长过程中的酶活信息

3．6．4 标准方法对照

3．7 本章小结

4 SECM实时监测黄曲霉孢子萌发过程的形貌和GOx酶活变化

4．1 前言

4．2 材料

4．3 仪器与设备

4．4 实验方法

4．4．1 黄曲霉孢子的培养

4．4．2 孢子的固定

4．4．3 SECM仪器和操作

4．5 结果与讨论

4．5．1 SECM监测黄曲霉孢子形貌与GOx酶活的原理

4．5．2 SECM条件研究

4．5．3 空白基底的SECM成像

4．5．4 单孢子的SECM成像

4．5．5 单孢子的SECM连续成像

4．5．6 单孢子萌发过程中GOx活性变化

4．5．7 干扰实验

4．6 本章小结

5 结论与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

6 创新点

参考文献

附录

致谢