糙皮侧耳的固态发酵产漆酶及染料脱色研究

摘要

本研究从4株菌菇原种中筛选出漆酶酶活较高的糙皮侧耳海南2号作为目标菌种，对其培养方式、所产漆酶性质及对合成染料的脱色等进行了分析。主要研究结果如下: 1.糙皮侧耳海南2号的培养基质。根据其在5种不同的固态果皮基质中的菌丝生长速度及所产漆酶酶活，确定柚皮为其发酵生长的最适固态基质。且在其中添加20μmol/L吐温-80可显著提高漆酶活性。 2.糙皮侧耳海南2号所产漆酶的分离纯化及酶学性质。从菌种固态发酵的粗酶液中分离纯化获得漆酶蛋白，经SDS-PAGE检测显示纯化产物为单一条带，分子量约为66 kD，将其命名为Lac h2。酶活分析表明以ABTS为底物，该漆酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为4.5，在30℃～50℃和pH4.5～6.0范围内保持稳定，其表观Km值为1.59×10-3 mol/L。在反应液中添加不同金属离子，发现Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+对该漆酶酶活有促进作用;Ca2+、Ag+、Fe2+对该漆酶活性有抑制作用，其中Fe2+抑制作用最明显。 3.漆酶对合成染料的脱色。使用糙皮侧耳海南2号固态发酵所产漆酶的粗酶液和纯化后的漆酶Lac h2溶液分别对活性艳蓝KN-R、孔雀石绿、苯胺蓝和刚果红进行脱色，发现均有一定的脱色效果，且添加介体ABTS可提高对染料的脱色率，但ABTS对不同的染料协助脱色效果存在差异。进一步研究发现，在使用纯化漆酶溶液进行染料脱色时，向反应液中添加相同浓度的活性艳蓝KN-R代替小分子介体ABTS，也能提高脱色率，但协助效果弱于介体ABTS。 4.菌种对合成染料的脱色。将糙皮侧耳海南2号置于果皮染料基质中固态发酵（胞内脱色），研究果皮对染料的吸附情况发现，发酵后的柚皮对活性艳蓝KN-R、孔雀石绿、苯胺蓝3种染料的吸附能力明显优于未发酵柚皮;但对刚果红的吸附能力变化不明显。在基质中添加不同浓度的介体ABTS，发现添加与否及添加量对染料脱色无明显影响。pH值分析发现，在溶液pH为7.5时，该菌株对活性艳蓝KN-R的脱色效果最好;在pH为4.5时，对孔雀石绿的脱色效果最好;在pH为6时，对苯胺蓝脱色最好在pH为7.5时，对刚果红脱色效果最好。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 木质纤维素

1．1．1 木质纤维素

1．1．2 木质纤维素的利用

1．1．3 柚皮渣

1．2 漆酶

1．2．1 漆酶的性质

1．2．2 漆酶的生产

1．2．3 漆酶的应用

1．3 合成染料

1．3．1 合成染料的现状

1．3．2 合成染料的特点

1．3．3 合成染料的降解脱色

1．3．4 白腐真菌对染料的脱色

1．4 本论文研究的目的和方案

1．4．1 论文研究的目的

1．4．2 论文的主要研究方案

第二章 目标菌种及培养基质的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌种

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要药品与原材料

2．1．4 主要试剂

2．1．5 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 目标菌种的筛选

2．2．2 菌种的固态培养

2．2．3 漆酶活力的测定

2．2．4 菌种固态培养单因素条件优化

2．3 结果与分析

2．3．1 不同菌种漆酶酶活的变化趋势

2．3．2 目标菌株在不同固态培养基中的菌丝萌发和生长及漆酶酶活的变化趋势

2．3．3 不同外源添加物对固态培养产漆酶酶活的影响

2．4 讨论

第三章 糙皮侧耳海南2号所产漆酶的分离纯化及酶学性质研究

3．1 实验材料

3．1．1 材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要药品

3．1．4 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 漆酶蛋白的分离纯化

3．2．2 菌种漆酶的酶学性质研究

3．3 结果与分析

3．3．1 漆酶蛋白的分离纯化及电泳检测

3．3．2 漆酶酶学性质

3．4 讨论

第四章 漆酶对合成染料的脱色

4．1 实验材料

4．1．1 材料

4．1．2 主要仪器

4．1．4 主要试剂

4．2 实验方法

4．2．1 漆酶对合成染料的胞外脱色

4．3 结果与分析

4．3．1 漆酶粗酶液对4种染料的脱色

4．3．2 纯化漆酶对4种染料的脱色

4．4 讨论

第五章 菌种对合成染料的脱色

5．1 实验材料

5．1．1 材料

5．1．2 主要仪器

5．1．3 主要药品

5．1．4 主要试剂

5．1．5 培养基

5．2 实验方法

5．2．1 柚皮发酵前后对染料的吸附

5．2．2 漆酶对染料的胞内脱色

5．3 实验结果

5．3．1 柚皮发酵前后对4种染料的吸附

5．3．2 介体添加量对糙皮侧耳海南2号胞内脱色的影响

5．3．3 pH值对糙皮侧耳海南2号胞内脱色的影响

5．4 讨论

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

致谢