弓形虫新疫苗候选分子编码基因的筛选、质粒构建及保护性研究

摘要

目的:筛选新的弓形虫病疫苗候选分子,构建弓形虫真核表达质粒pcDNA3/T.g-R1,并观察重组质粒所诱导的保护性免疫应答.方法:1、用感染弓形虫的大鼠血清和正常大鼠血清免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库,对阳性克隆测序并进行序列分析;2、通过各种数据库和分析软件对新基因编码的蛋白质结构、功能及细胞表位进行预测;3、采用PCR扩增出T.g-R1目的基因,用EcoRⅠ/Xho Ⅰ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切,将T.g-R1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/Xho Ⅰ位点;对重组质粒进行PCR扩增、双酶切初步鉴定后作序列测定;4、大量制备并提纯重组质粒pcDNA3/T.g-R1,肌肉注射法免疫小鼠;ELISA法检测特异性抗体水平;PCR检测肌肉组织DNA中T.g-R1基因;弓形虫RH株速殖子攻击感染免疫鼠,观察其发病时间和存活时间.结果:1、通过筛选弓形虫cDNA文库,共获得18个阳性克隆.经序列测定发现插入片段的大小在0.45kb-3.2kb之间,查询所有基因库并经ExPASy(Expert Protein Analysis System)软件分析鉴定出10个新的基因,GenBank登录号分别为AY180109、AY185205、AY186540、AY208749、AY207004、AY208944、AY208675、AY208748、AY186539和AY349162;2、对所有新基因进行生物信息学分析,包括蛋白质结构、功能及细胞表位的预测;3、成功构建重组质粒pcDNA3/T.g-R1,DNA序列测定结果表明将大小为405bp的T.g-R1片段定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/Xho Ⅰ位点;4、经pcDNA3/T.g-R1免疫的小鼠血清中检测到特异性抗体,以肌肉组织DNA为模板特异地扩增出T.g-R1基因,用弓形虫强毒株速殖子攻击感染各免疫组小鼠,pcDNA3/T.g-Ri免疫组的保护性与空质粒对照组比较无明显优越性,但均明显优于生理盐水对照组.结论:从弓形虫cDNA文库中分离出10个弓形虫新基因并对其进行了生物信息学分析;成功构建了pcDNA3/T.g-R1真核表达质粒,初步结果显示用pcDNA3/T.g-R1质粒免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,但对弓形虫强毒株无明显保护性.

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一章大鼠血清免疫筛选弓形虫cDNA文库

1.1材料和方法

1.2结果

1.2.1 cDNA文库的筛选结果

1.2.2 PCR初步鉴定阳性克隆插入片段

1.2.3阳性克隆的DNA测序鉴定与序列分析

1.3讨论

1.4小结

第二章新基因编码蛋白质的生物信息学分析

2.1材料和方法

2.2结果

2.2.1新基因编码的蛋白质结构和功能预测

2.2.2新基因T.g-R1、L7和L11编码氨基酸的B细胞表位预测

2.3讨论

2.4小结

第三章新基因真核表达质粒pcDNA3/T.g-R1的构建、表达与保护性效果观察

3.1材料与方法

3.2结果

3.2.1目的基因的PCR扩增

3.2.2表达质粒pcDNA3/T.g-R1的构建及鉴定

3.2.3免疫鼠血清特异性抗体的检测

3.2.4组织中重组质粒DNA的PCR检测

3.2.5抗攻击感染的免疫保护作用

3.3讨论

3.4小结

参考文献

不同动物对弓形虫敏感性的差异及其应用价值

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

附录