siRNA阻断Smad3表达对TGF-β1诱导的C2C12细胞增殖、分泌细胞外基质及基质金属蛋白酶影响

摘要

目的通过观察Smad3基因的RNA干扰(RNAi)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠肌成纤维细胞(C2C12)的增殖和分泌细胞外基质及基质金属蛋白酶的影响，探讨RNAi技术在阻断TGF-β1-Smad3信号通路中的应用和TGF-β1-Smad3在肌成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质及其基质金属蛋白酶中的作用，进一步探讨器官纤维化的发病机理，为设计siRNA药物和治疗纤维化疾病提供理论依据和实验资料。 方法用不同浓度(0、1、5、10ng/ml)TGF-β1干预C2C12细胞24h，观察其增殖和分泌Ⅰ型胶原(collagentype1)、膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的改变。利用体外转录合成的Smad3基因短干扰RNA(siRNA-Smad3)，经脂质体包裹转染C2C12细胞24h，以阻断Smad3基因表达。实验分为实验组(siRNA-Smad3+5ng/mlTGF-β1)、内对照组(siRNA-control+5ng/mlTGF-β1)和空白对照组(siRNA-control+0ng/mlTGF-β1)。用Westernblot检测Smad3和磷酸化的Smad3(P-Smad3)；用MTT法和3H-Thymidine法观察C2C12细胞增殖；用ELISA法检测Ⅰ型胶原的分泌，用RT-PCR法检测其基因表达；用Westernblot检测MT1-MMP的表达，用Northernblot检测其基因表达；用ELISA法检测MMP-2的分泌和激活。 结果(1)5ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞0、0.5、1、2、5、6小时，促进Smad3磷酸化。0.5小时开始诱导Smad3磷酸化，5小时高峰(6孔培养板)。(2)0、1、5、10ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞5小时，诱导Smad3磷酸化呈剂量依赖性。(3)50、100、200pmol/LsiRNA-Smad3+Lipofectamine2000转染C2C12细胞24小时，Smad3表达逐渐被抑制到无表达。200pmol/LsiRNA-control与controlSmad3表达基本一致，无改变。(4)200pmol/LsiRNA-Smad3+Lipofectamine2000转染C2C12细胞24小时后，加5ng/mlTGF-β1干预5小时，Smad3无表达。20pmol/LsiRNA-control转染组Smad3表达无影响，Smad3磷酸化存在。(5)0、1、5、10ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞24小时，促进C2C12细胞增殖，其MTT(OD值)分别是0.096±0.015，0.177±0.014，0.240±0.028，0.312±0.012，[3H](cpm/min)值分别是630±17，907±19，1493±25，1808±24。(6)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control转染C2C12细胞24小时后，用0，5ng/mlTGF-β1分别干预24小时，实验组增殖无改变；而对照组细胞增殖增强。实验组MTT值和[3H]值分别为0.063±0.011、428±38，内对照组分别为0.137±0.016、1062±50，空白对照组分别为0.066±0.006、464±30。实验组和内对照组比较差异有显著性(P＜0.05)；实验组和空白对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。(7)0、1、5、10ng/mlTGF-β1分别干预C2C12细胞24小时，促进细胞外基质Ⅰ型胶原分泌。其ELISA法(CICP，ng/ml)检测结果分别为616±16，713±19，783±23，853±17，RT-PCR法(Ⅰ型胶原/β-actin光密度比值)分别为0.93±0.08，1.83±0.17，2.50±0.29，2.94±0.14。(8)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control转染C2C12细胞24小时后，用0、5ng/mlTGF-β1分别干预24小时后，ELISA法检测Ⅰ型胶原，实验组无改变(413±20ng/ml)，空白对照组无改变(473±29ng/ml)，而内对照组分泌增强(571±29ng/ml)。用RT-PCR(半定量)检测其基因表达，实验组无改变(0.78±0.17)，空白对照组无改变(0.86±0.10)，而内对照组表达增强(1.85±0.19)。实验组和内对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，实验组与空白对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。(9)C2C12细胞表达MT1-MMP,MMP-2(Westernblot)，0、1、5、10ng/miTGF-β1分别干预C2C12细胞24小时后，抑制MT1-MMP分泌和基因表达(Westernblot、Northernblot)。200pmol/LsiRNA-Smad3、siRNA-control转染C2C12细胞24小时后，用0.5ng/mlTGF-β1干预24小时后，实验组有MT1-MMP基因表达，而对照组无表达。(10)0、1、5、10ng/mlTGF-β1分别干预C2C12细胞24小时后，活性型MMP-2(ELISA)(ng/ml)值分别为23.09±4.37、14.42±2.30，9.50±1.18，and4.48±0.69ng/ml，而总MMP-2值分别为177±20，180±15，171±18，179±28ng/ml。用5ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞在不同时间里，活性型MMP-2(ELISA法)值分别为16.53±2.56ng/ml(4h)、8.00±2.02ng/ml(12h)、9.39±2.60ng/ml(24h)，总MMP-2值分别为157±17ng/ml(4h)、174±16ng/ml(12h)、189±18ng/ml(24h)aTGF-β1抑制MMP-2激活，对其基因表达无影响。(11)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control转染C2C12细胞24小时后，用0，5ng/mlTGF-β1分别干预24小时，活性型MMP-2值(ELISA)为：实验组20.09±2.27ng/ml，内对照组9.82±2.18ng/ml，空白对照组20.80±1.53ng/ml。实验组和内对照组比较差异有显著性(P＜0.05)；实验组和空白对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。 结论(1)TGF-β1促进C2C12细胞Smad3磷酸化呈剂量与时间依赖性；siRNA阻断C2C12细胞Smad3表达与Smad3磷酸化。(2)TGF-β1促进C2C12细胞增殖呈剂量依赖性；siRNA阻断Smad3表达消除了TGF-β1的促C2C12细胞增殖作用。(3)TGF-β1促进C2C12细胞Ⅰ型胶原合成与mRNA表达呈剂量依赖性，siRNA阻断了Smad3表达消除了TGF-β1的促进Ⅰ型胶原合成与mRNA表达作用。(4)TGF-β1抑制C2C12细胞MT1-MMP蛋白和mRNA表达呈剂量与时间依赖性；siRNA阻断Smad3表达消除了TGF-β1的抑制MT1-MMP蛋白和mRNA表达作用。(5)TGF-β1抑制C2C12细胞MMP-2的激活呈剂量与时间依赖性；siRNA阻断Smad3表达消除了TGF-β1的抑制MMP-2激活作用。TGF-β1对C2C12细胞MMP-2表达无影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

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前言

第一部分RNA干扰(RNAi)阻断C2C12细胞内源性Smad3表达

第二部分 siRNAi阻断Smad3表达对TGF-β 1诱导C2C12细胞增殖的影响

第三部分 siRNAi阻断Smad3表达对TGF-β 1诱导C2C12细胞外基质Ⅰ型胶原分泌的影响

第四部分 siRNAi阻断Smad3表达对TGF-β 1抑制C2C12细胞MTI-MMP基因表达的影响

第五部分 siRNAi阻断Smad3表达对TGF-β 1抑制C2C12细胞MMP-2激活的影响

结论

参考文献

综述1 转化生长因子β1在心肌纤维化中的作用

综述2 RNA干扰技术研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文