缺氧对人肝癌细胞株BEL-7402多药耐药性的调控及HIF-1αRNAi对MDR1的干涉作用

摘要

研究背景：原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，目前治疗肝癌的方法是以手术、化疗和放疗为主的综合性治疗。由于肝癌不属于对化疗敏感的肿瘤，全身化疗的效果较差，无论是单个化疗药物的应用或是联合应用，效果均不理想。肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)是临床恶性肿瘤化疗的主要障碍，也是肿瘤患者化疗失败，复发转移的原因之一。因此多药耐药的产生机制和逆转方法的研究成为科学家们的研究重点。 HIF-1 是一个普遍存在于哺乳动物细胞内的缺氧应答调控因子。在恶性肿瘤低氧微环境中处于重要的中枢调节地位，其调控的下游靶基因40种，除涉及肿瘤生长、发展、侵袭、肿瘤细胞凋亡、血管生成外，还导致肿瘤细胞对放化疗的抵杭，其表达水平对恶性肿瘤的化疗敏感性与预后具有重要的影响。 传统逆转MDR的药物由于逆转剂量对机体的副作用极大而在临床应用中受到限制，多药耐药产生机制和有效逆转靶点的研究成为极具价值的攻克肿瘤和肿瘤耐药的关键，因此寻找新的针对肝癌多药耐药的目的基因是急待研究的课题。对肿瘤缺氧微环境与多药耐药关系的研究有助于发现多药耐药产生的机制，并为癌症治疗和多药耐药逆转提供新的作用位点和治疗途径。 而RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年兴起的高效且特异特定基因的新技术，主要是将21bp的小干扰RNA(small rferenceRNA,siRNA)转染进细胞，通过序列特异的降解作用，能有效封闭靶mRNA 和降低蛋白质水平。 第一部分，目的：探讨HIF-1α、PTEN和P-gp在原发性肝细胞癌中的表达，以及与临床病理因素及相互的关系。 方法：用免疫组化法检测43例原发性肝细胞癌中HIF-1α、PTEN和P-gp的表达情况，探讨HIF-1α、PTEN和P-gp与肝癌多药耐药的关系，并分析HIF-1α、PTEN和P-gp与肝癌临床病理因素的关系。另取7例正常肝组织作为对照。 结果：在43例肝癌标本中，HIF-1α、PTEN和P-gp蛋白阳性表达分别为：60.5％(26/43)、46.5％(20/43)、51.2％(21/43)％。而7例正常的肝组织阳性表达分别为：14.2％(1/7)、100％(7/7)、0％(0/7)。在肝癌组织中HIF-1α、PTEN和P-gp蛋白阳性表达差异具有显著性(P<0.05)，HIF-1α蛋白表达与肿瘤的大小、分化程度有关，PTEN 蛋白表达与肝癌的分化程度、有无静脉或胆道癌栓有关，P-gp蛋白表达肿瘤的大小、有无门静脉、胆道癌栓有关。HIF-1α、PTEN蛋白阳性表达呈负相关性，PTEN和P-gp蛋白阳性表达呈负相关性，HIF-1α、P-gp蛋白阳性表达呈正相关性。 结论： (1)原发性肝癌组织存在着HIF-1α、P-gp蛋白的过表达以及PTEN的表达缺失； (2)HIF-1α的表达与原发性肝细胞癌的分级、分期具有明显的相关性；HIF-1α的过表达与抑癌基因PTEN的缺失呈负相关； (3)PI(3)k/PTEN/Akt/HIF-1α信号传导途径通过上调P-gp的表达，导致肝癌多药耐药的产生。 第二部分，目的：在细胞水平观察缺氧的肝癌细胞株BEL-7402中HIF-1α和肿瘤多药耐药基因(Mufti-drug Resistance，mdrl)在转录水平和蛋白质水平上各组表达的变化，探讨缺氧状态下HIF-1α对肝癌细胞多药耐药基因表达的调控机制。 方法：本部分采用CoCl<,2>建立缺氧诱导模型。 1、检测肝癌细胞株BEL-7402分别在常氧和缺氧状态下对阿霉素的IC<,50>； 2、分为给药组、缺氧+给药组、和缺氧组，并另设正常对照组，分别培养24h、48h； 3、流式细胞仪检测肝癌细胞株BEL-7402分别在以上各组中的细胞凋亡率； 4、RT-PCR 检测HIF-1α和MDR1的mRNA在肝细胞肝癌BEL-7402细胞中的表达水平。 5、Western-blo t检测HIF-1α和MDR1的蛋白在肝细胞肝癌BEL-7402细胞中的表达水平。 结果： 1、肝癌细胞株BEL-7402 分别在常氧和缺氧状态下对阿霉素的IC<,50>分别为0.362±0.043 ug/ml、0.686±0.079 ug/ml，(P<0.05)。 2、RT-PCR证实缺氧6h后HIF-1amRNA是正常对照组的1.49倍(P>0.05)，缺氧12h后升高1.97倍，缺氧24h后HIF-1amRNA是正常对照组的2.94倍。缺氧48h后HIF-lamRNA是正常对照组的2.14倍。缺氧6h后MDR1mRNA是正常组的1.64倍(P<0.05)；缺氧12h后MDR1mRNA是正常组的2.01倍，缺氧24h后MDR1mRNA是正常对照组的3.82倍。缺氧48h后MDR1mRNA是正常对照组的5.18倍(P<0.05)。 3、western Blot证实缺氧缺氧6h后HIF-1α蛋白是正常对照组的1.17倍，缺氧12h后HIF-1α蛋白是正常对照组的2.56倍，缺氧24h后HIF-1α蛋白是正常对照组的3.33倍。缺氧48h后HIF-1α蛋白是正常对照组的5.33倍(P<0.05)。缺氧6h后P-gp蛋白是正常对照组的1.44倍，缺氧12h后P-gp蛋白是正常对照组的1.84倍，缺氧24h后P-gp 蛋白是正常对照组的5.96倍。缺氧48h后P-gp蛋白是正常对照组的6.84倍(P<0.05)。 结论： 1、用100μmol/L 的CoCL<,2>可以诱导肝癌细胞株BEL-7402发生缺氧，而且并不影响细胞的生长； 2、缺氧环境可以诱导肝癌细胞株BEL-7402对阿霉素的耐药性增强； 3、任发生缺氧的肝癌细胞株BEL-7402中，HIF-1α具有调控MDR1表达的作用，HIF-1α对MDR1的调控主要是在转录水平进行的。 第三部分，目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，研究表达HIF-1α的小发夹RNA(shRNA)载体对肝癌细胞株BEL-7402的影响。 方法：根据靶基因的不同区域设计两组shRNA以及一个空白对照，利用阳离子脂质体转染入肝癌细胞株BEL-7402、孵育24h、48h后，RT-PCR 检测肝癌细胞株BEL-7402 HIF-1α和MDR1mRNA的变化，Western blot检测HIF-1α和P-gP蛋白的表达。 结果： 1、RT-PCR 检测缺氧状态下，肝癌细胞株BEL-7402瞬时转染shRNA载体24h、48h后，HIF-1αmRNA分别为0.75±0.01、0.71±0.04、1.11±0.01：0.68±0.04、0.65±0.02、0.91±0.02。MDR1mRNA 分别为0.68±0.04、0.65±0.02、0.91±0.02；0.75±0.01、0.71±0.04、1.11±0.01。 2、 Western Blot检测缺氧状态下，肝癌细胞株BEL-7402瞬时转染shRNA载体24h后，HIF-1α蛋白表达分别为0.53±0.02、0.51±0.03、0.65±0.03；而转染48h后，HIF-1α蛋白表达比值分别为0.51±0.02、0.45±0.02、0.72±0.03。肝癌细胞株BEL-7402瞬时转染shRNA载体24h、48hh后，P-gP蛋白的表达分别为0.84±0.03、0.81±0.02、1.02±0.05：0.88±0.05、0.81±0.03、1.35±0.03。 结论： 1、成功筛选出两条能特异而高效地抑制HIF-1α基因表达的shRNA，为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段； 2、缺氧状态下，肝癌细胞株BEL-7402瞬时转染HIF-1α siRNA 载体后HIF-1α mRNA 表达被显著抑制，同时也可以显著抑制缺氧所导致的 MDR1mRNA.升高； 3、缺氧状态下，肝癌细胞株BEL-7402瞬时转染HIF-1α siRNA 载体后 HIF-1α蛋白表达被显著抑制，同时也可以逆转缺氧所导致的P-gp蛋白升高； 4、本研究显示，质粒载体介导的siRNAs系统是一个有发展潜力的下调靶基因表达的方法，可以在人细胞内“敲除”HIF-1α基因，调节其下游基因MDR1mRNA及P-gp蛋白的表达，恢复肝癌细胞株BEL-7402 在缺氧状态下对化疗药物的敏感性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

前言

第一部分HIF-1α、MDR1、PTEN在肝癌中的表达及临床意义

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

小结

第二部分缺氧状态下肝癌细胞株BEL-02对阿霉素化疗敏感性影响的研究

材料与方法

实验结果

讨论

结论

第三部分缺氧状态下RNA干扰HIF-1α对肝癌细胞株BEL-7402 MDR1的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

综述二RNA干扰技术及其在肝胆外科中的作用

参考文献

致谢