人类胚胎干细胞体外培养过程中Wnt基因在饲养层和人类胚胎干细胞中的差异表达及Wnt9a的RNAi研究;生精相关新基因Cymg1和Rcet1的克隆及初步功能研究

摘要

研究目的：对核型正常和异常的人类胚胎干细胞(hESCs)在体外培养过程中Wnt基因在饲养层和hESCs中的差异表达分析，分别筛选出可能促进hESCs正常增殖和引起核型发生变化的候选Wnt基因，并对其中的Wntga候选基因进行RNAi(RNA干扰)研究，了解其生理功能；在小鼠睾丸或生殖域中克隆与生精相关的新基因，并对其功能进行初步研究。 研究方法：用RT-PCR方法对核型正常和异常的hESCs在体外培养过程中Wnt基因在饲养层和hES细胞中的差异表达分析，分别筛选维持hESCs正常增殖和促使其核型变化的候选基因；用RT-PCR、原位杂交、免疫组化、细胞定位和过表达方法研究其定位和表达，并构建pAVU6+27／siWnt9as针对人Wnt9aRNA干扰的表达载体，采用原位杂交方法检测RNA干扰效应，以及流式分析过表达和低表达人Wnt9a对细胞周期的影响；应用DDD(数据库削减杂交)结合实验方法，克隆在睾丸或生殖域中特异表达的新基因，采用RT-PCR、Northern、原位杂交、免疫组化、蛋白表达和细胞定位等方法研究新基因的初步功能。 研究结果：①Wnt7a在培养核型正常hESCs 6天后的hEFs(人类胚胎成纤维细胞)和ICR小鼠胚胎成纤维细胞(mEFs)中表达，在对照和培养第一号染色体核型异常的hESCs 6天后的hEFs和ICR mEFs中无表达。Wnt3a在培养核型正常hESCs 6天后的ICR mEFs中高表达，在对照和培养核型异常hESCs 6天后的ICR小鼠mEFs中无表达。Wnt3在培养第一号染色体核型异常的hESCs 6天后的hEFs和ICR mEFs中表达，且表达量逐渐增强，对照和培养核型正常hESCs后的hEFs中无表达；但培养正常hESCs 6天后的ICR和昆明小白鼠mEFs中有Wnt3的表达；同时，昆明小白鼠mEFs对照中也有Wnt3的表达。Wnt9a的表达量在未培养正常hESCs的hEFs中表达量高，而在养hESCs后的hEFs中表达量低。Wnt16在培养正常hESCs 6天后的昆明小白鼠mEFs中有较高的表达，而对照和hEFs及ICR小鼠mEFs中均无Wnt16表达。②Wnt9a在人3个月胚胎的多组织中均表达；原位杂交和免疫组化表明Wnt9a在MCF-7人乳腺癌细胞和hESCs中表达；Wnt9a，定位在胞浆中表达；原位杂交检测表明转染了pAVU6+27／siWnt9as的MCF-7细胞无杂交信号或杂交信号弱，未转染pAVU6+27／s iWnt9as的MCF-7细胞有杂交信号；与对照相比，过表达人Want9a导致了MCF-7细胞G1期延长、S期和G2期缩短；低表达人Wnt9a导致了MCF-7细胞G1期缩短、S期和G2期延长。③从小鼠睾丸eDNA文库中克隆了2个全长分别为780和454／610个碱基对的新基因Cymgl和Rcetl(Rcel_vl和Rcetl_v2)，均含4个外显子和3个内含子，均定位在小鼠2G3上；全长eDNA完整阅读框分别编码141和88／140个氨基酸残基，均具有一个CY结构域，与CRES亚家族一样，缺少半胱氨酸蛋白酶抑制作用关键性的共同位点；RT-PCR和Northern杂交显示(ymgl在成年小鼠睾丸组织中特异表达；免疫组化显示CYMGl在精原细胞，精母细胞，圆形精子细胞，正在延伸的精子细胞和精子中表达；CYMGl定位在胞浆中表达；诱导了CYMGl融合蛋白在原核系统中的表达，并制备了CYMGl特异的多克隆抗体。RT-PCR显示Cymgl在小鼠出生后1周的睾丸中表达量低，第2周到第5周逐渐增加，第七周表达量最高，13-57周保持在第5周的表达水平。RT-PCR显示Rcetl在小鼠睾丸、副睾、大脑和脑垂体中特异表达；原位杂交显示Rcetl在小鼠精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞中表达，在精子中不表达；RT-PCR显示Rcetl在小鼠出生后5周睾丸中即有表达，然后逐渐增高，在第8、9周时达到最高值，第10周、57周表达保持稳定表达趋势，而且表达量与第七周相当。 结论：①Wnt3a和Wnt7a可能是维持hESCs正常增殖的环境因子；Wnt3和Wnt16可能是昆明小白鼠mEFs引起正常hESCs发生核型变化的原因；Wnt9a可能起调节hESCs增殖速度的作用，对hESCs的核型变化可能没有直接的影响。②设计的4对siWnt9as均具有RNA干扰效果；Wnt9a的过表达抑制细胞增殖，Wnt9a的低表达促进细胞增殖；原位杂交能有效而直观地检测出瞬时转染的RNA干扰现象，克服了常规方法难以检测的难题。③运用DDD法并结合实验克隆了具有在睾丸组织中特异表达的新基因Cymgl和在生殖域中表达的新基因Rcetl(Rcetl_vl；Rcetl_v2); CYMGl和RCETl(RCETlv1；RCETlv2)均含一个CY结构域，与CRES具有相似的结构位点，可能属于CRES亚家族的两个新成员；Cymgl可能与精子的发生和性成熟相关，Rcetl(Rcetl_vl；Rcetl_vl)可能与精母细胞的发生相关。

目录

文摘

英文文摘

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实验技术路线图

第一章综述

第二章材料和方法

第三章研究结果

第四章讨论

结论

参考文献

致谢

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