嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜蛋白的快速有效分离及双向电泳图谱的建立

摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌是革兰氏阴性、化能自养菌，能通过氧化Fe2+、各种还原性硫化物以及H2提供生长能量。外膜蛋白是嗜酸氧化亚铁硫杆菌的重要组成成分，在物质转运、信息识别、细胞吸附等方面起着重要作用。外膜蛋白的分离是对其进行进一步研究的必要条件，但是传统的分离方法耗时长、仪器设备要求高、步骤繁多，同时很难严格地将质膜蛋白与外膜蛋白区分开来。 本论文以大肠杆菌为模式菌，运用温度诱导的双水相萃取分离技术建立了一种快速、有效的分离革兰氏阴性细菌外膜蛋白的方法体系。系统地研究了不同浓度的Triton X-114对外膜蛋白提取效率的影响，结果表明8％的Triton X-114为外膜蛋白分离的合适浓度。为摸索Triton X-114的最佳处理时间，以8％的Triton X-114分别处理未经机械破碎的嗜酸氧化亚铁硫杆菌1h、2h、3h、4h、5h，发现处理3h后外膜蛋白的提取效率达到最佳。分离得到的蛋白质样品，经透析除盐处理后，可用于双向电泳分析。通过对比实验发现双向电泳样品裂解液中包含低浓度的Tris是外膜蛋白双向电泳成功的关键，CHAPS与ASB-14或NP-40结合使用比单独使用CHAPS效果更佳，可显著提高外膜蛋白的溶解能力，增加蛋白斑点，缩短聚焦时间，从而优化了外膜蛋白双向电泳技术体系，建立了外膜蛋白双向电泳图谱。 采用优化后的双水相萃取分离体系选择性分离了嗜酸氧化亚铁硫杆菌的外膜蛋白。对所分离到的蛋白质样品进行了双向电泳分析，并建立了不同能源基质培养条件下嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜蛋白的双向电泳差异图谱。为进一步研究不同能源基质培养条件下嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜蛋白差异蛋白质组学奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词简表

声明

第一章绪论

1.1 生物冶金

1.2 微生物冶金的特点

1.3 微生物冶金作用机理

1.3.1 直接作用

1.3.2 间接作用

1.4 A.ferrooxidans的能量代谢研究进展

1.4.1A.ferrooxidans铁氧化系统

1.4.2 A.ferrooxidans元素硫氧化系统

1.5 革兰氏阴性细菌的细胞包被结构

1.5.1 细胞包被结构

1.5.2 膜内在蛋白与膜脂结合的方式

1.6 外膜蛋白的提取方法

1.6.1 去污剂

1.6.2 等密度梯度离心法

1.6.3 N-十二烷基肌氨酸钠选择性溶解质膜蛋白法

1.6.4 碳酸钠法

1.6.5 温度诱导两相分离萃取技术

1.7 双向电泳

1.7.1 样品制备

1.7.2 样本裂解液的组成

1.7.3 双向电泳步骤

1.8 论文研究目的、意义及内容

第二章 大肠杆菌外膜蛋白的分离

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 试剂

2.2.2 蛋白质浓度的测定

2.2.3 大肠杆菌的培养与收集

2.2.4 Triton X-114最佳浓度的确定

2.2.5 最佳处理时间的确定

2.2.6 SDS-PAGE分析

2.2.7 染色

2.3 结果与讨论

2.3.1 Triton X-114的浓度对外膜蛋白提取效率的影响

2.3.2 时间对外提取效率的影响

2.2.3 去污剂相蛋白与水相蛋白的比较

2.4 小结

第三章 外膜蛋白双向电泳体系的建立

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 试剂

3.2.2 大肠杆菌外膜蛋白的分离

3.2.3 蛋白质的浓度测定

3.2.4 外膜蛋白双向电泳分析最佳样品裂解液的确定

3.2.5 外膜蛋白双向电泳等电聚焦电泳参数的确定

3.2.6 胶条平衡

3.2.7 第二向电泳

3.2.8 染色

3.3 结果与讨论

3.3.1 不同聚焦时间对双向电泳结果的影响

3.3.2 不同样品裂解液对双向电泳结果的影响

3.4 小结

第四章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜蛋白的分离及双向电泳图谱的建立

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株、培养基和培养条件

4.2.2 试剂

4.2.3 A.ferrooxidans细菌外膜蛋白的分离与提取

4.3 结果与讨论

4.3.1 特化空间双向电泳图谱的比较

4.3.2 元素硫培养细菌与亚铁培养细菌外膜蛋白表达差异谱的建立

4.4 小结

第五章 总结

参考文献

致谢

攻读学位期间主要的研究成果