H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达纯化以及耐奥司他韦神经氨酸酶动力学研究

摘要

高致病性禽流感病毒H5N1能够打破宿主限制“禽传人”，造成人感染禽病毒H5N1的病例。禽流感病毒H5N1尚不具备“人传人”的能力。宿主限制主要与血凝素受体结合特性有关。近期基因分析研究表明，某些人禽流感病毒H5N1在受体结合部位也有突变。本研究第一部分旨在从HA晶体结构解析，进一步推测H5N1病毒HA对宿主细胞受体结合特性的改变，可否使禽流感病毒H5N1具备“人传人”的能力。首先用定点突变技术在H5 HA受体结合部位或临近位点引入目的氨基酸变异A134V、I151F、E186D和I151F+A134V+E186D。再通过反向遗传学方法拯救带有这些变异位点的重组流感病毒，结果发现H5 A134V和H5 E186D均能在鸡胚传代中稳定表达，并且得到了这两种HA晶体，及HA-人/禽受体结合复合物的晶体X线衍射图，从而分析得出H5 E186D倾向于结合人受体而H5 A134V受体结合特性与野生型HA相同--倾向于结合禽受体。另一个变异位点H51151F在鸡胚传代后变成了H5 F151L，提示I151F不利于病毒在鸡胚中繁殖，可能与该位点弱化HA与鸡胚中的禽受体SAα2，3 Gal结合有关。为了进一步证实该假设，我们通过构建重组牛痘病毒表达并纯化H5 I151F和H5 I151F+A134V+E186D，首次成功获得了H5 I151F晶体，为后续开展晶体结构解析和多聚糖微阵列分析HA受体结合特性等工作，进一步研究禽流感病毒人传人的可能性打下基础。 为了应对下一次流感大流行的到来，很多国家将神经氨酸酶抑制剂-奥司他韦做为一种战略储备药物来储存。随着该药物的广泛使用，奥司他韦耐药现象也日趋突显。以往的研究重点局限在N1的H274Y，H253Y和N294S。本研究中我们主要研究N1的另外两个氨基酸变异位点I117V和I134V。这两个突变首先在鸡流感病毒H5N1中被发现有降低奥司他韦药敏的作用。如果人感染了带有这些氨基酸突变的H5N1病毒，临床上还能不能用奥司他韦抗病毒治疗?为此，我们将这两个突变位点引入人感染的H5N1病毒，通过该病毒对神经氨酸酶的酶促反应动力学研究得出将这两个变异引入能感染人的H5N1 NA，并不会导致病毒对奥司他韦耐药，但仍能使病毒对奥司他韦敏感性降低，这可能与该位点临近NA活性中心的保守氨基酸E119，从而间接影响药物与NA的结合有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词中英文对照

声明

第一部分重组牛痘病毒表达反向遗传学H5N1病毒的血凝素蛋白

第一章：研究背景

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论和意义

第二部分：H5N1耐奥司他韦神经氨酸酶动力学研究

第一章：研究背景

第二章材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论和意义

参考文献

致谢

攻读学位期间发表文献