β-硫基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化神经元细胞的实验研究

摘要

目的：⑴大鼠骨髓间质干细胞体外培养特性，探讨MSCs的体外分离、培养、扩增的规律和特点。建立SD大鼠骨髓间充质于细胞体外培养体系。⑵采用β-硫基乙醇（β-ME）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为诱导剂，对骨髓间充质干细胞（BMSC）进行体外诱导实验。探讨β-ME和bFGF体外诱导骨髓间充质干细胞分化神经元细胞的机制，为脊髓损伤的细胞移植治疗提供实验基础。 方法：①取一月龄SD大鼠股骨和胫骨，采用全骨髓培养法，以L-DMEM完全培养基冲出骨髓过滤后直接接种于培养瓶中，3天后首次换液，以后每3天换液一次。至细胞融合达80％以上时，进行传代。②取第1、4、7、10、13代细胞，观察其细胞生长曲线及贴壁率。③取第4代细胞，采用流式细胞仪检测。④取P4代的rBMSC，以2×104/ml浓度接种于24孔板内，待细胞达到70％～80％融合时，分别加入β-硫基乙醇（β-ME）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化。⑤采用细胞免疫荧光方法，对以上两组细胞诱导后5h后检测神经元标志物TuJ1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达情况，荧光显微镜下观察并拍照记录。⑥荧光显微镜下在各组细胞随机取300个细胞，计数TuJ1反应阳性细胞个数，检验各组不同时间点的差异，以及每个时间点各组间的差异。统计学分析数据均以x±s表示，并用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。⑦免疫印迹法（Western blotting）检测分化细胞的特异性标志物分别取诱导分化后0h，1h，5h后的细胞，使用2X SDS sample buffer裂解细胞，进行神经元特异性蛋白TuJ-1和星形胶质细胞特异性蛋白GFAP的定量分析。 结果：⑴贴壁筛选法，通过多次换液可以分离、纯化BMSC，该法简单、方便、效果好。⑵BMSC在体外培养中有很强的增殖能力，10代以前的细胞形态较一致，增殖能力强，随传代次数的增加，增殖能力减弱，形态发生不规则变化。细胞生长的第1、4、7、10、13代的贴壁率变化规律基本相同，无显著区别。传代后细胞贴壁率随时间延长而增高。⑶rBMSC的表面标志抗原呈现多样性的特征，rBMSC不表达造血细胞表面抗原CD34、CD45，说明rBMSC非造血类细胞；而其表达CD90、CD44，说明rBMSC的表面标志具有非单一性的特性。它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。⑷第4代rBMSC加入诱导剂后可分化为神经元细胞和星形胶质细胞。可见光下观察：前者细胞体积较小数量较少，常有数个短小突起和一个较长的突起，呈典型的双极、多极或锥形，具有较强的折光性；后者细胞体积较大，细胞突起较多且粗，有些形态呈星状，有许多突起呈放射状伸出，平铺在培养皿上。⑸细胞免疫荧光结果示细胞诱导后5h，部分细胞TuJ1反应阳性，为神经元细胞；部分细胞GFAP反应阳性，为星形胶质细胞。⑹rBMSC诱导为神经元细胞阳性率比较，经统计学分析，诱导后β-ME组1h，5h分化率最高，24h bFGF组分化率最高，与其它组有显著差异（P<0.01）；β-ME组在诱导24h后多数细胞已死亡，无法统计。β-ME组1h与5h的分化率有显著差异（P<0.01）；bFGF组5h和24h的分化率与1h的分化率有显著差异（P<0.01），但5h和24 h的分化率无显著差异（P>0.05）。⑺Western Blotting检测结果显示，在上样20ug总蛋白，随着诱导时间的延长，rBMSC诱导分化后，表达TUJ-1和GFAP的量明显增加。并且，随着诱导时间的延长干细胞分化成神经元和神经胶质细胞的数量增多。 结论：①本实验采用骨髓直接培养法来分离培养BMSC，方法简单，效果亦可靠，通过数代的传代扩增就能获得高纯度、高数量的rBMSC，以满足组织工程实验研究的需要。②采用β-硫基乙醇（β-ME）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为诱导剂，体外诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）可分化为神经元细胞和星形胶质细胞。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1 干细胞与神经系统疾病

2 骨髓间质干细胞作为替代细胞的来源

3 由骨髓间质干细胞诱导为神经样细胞

4 本研究的主要内容和目的:

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 rBMSC体外诱导分化神经元细胞

1 材料与方法

2 结果:

3讨论

附图

参考文献

综述:脊髓损伤病理机制及干细胞移植治疗的研究进展

致谢