极低频电磁场联用X线辐射和磁性纳米粒子及其在肝癌治疗中的应用研究

摘要

目前,生命科学的探索缺乏系统理论的指导。肿瘤是生命体系中典型代表之一。本研究拟利用物理化学开放式系统理论来指导肿瘤的治疗研究。肿瘤细胞来源于正常细胞,和正常细胞主要区别在于其不受周边组织限制的增长,自成结构,形成一个不受制约的有着输入和输出的开放式系统。一个快速膨胀的开放式系统来不及自我修复和完善,意味着其系统内积聚的损伤不同于正常的生命系统那样容易修复；且在一个系统里,当损伤积聚至临界点时,一个微小的扰动都能导致系统崩溃。基于此点,本文利用物理手段--极低频电磁场ELF—EMF在肿瘤细胞内特异性的积聚这种微小损伤,而正常细胞系统往往能及时修复这种微小损伤而不会积累这种微小损伤,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞伤害较小的目的。目前,丧失手术治疗机会后的晚期肝癌尚无有效的治疗手段。因此本文将肝癌细胞和肝细胞作为研究该治疗手段的模型。
　　 由于低频电磁场单独应用其致细胞凋亡作用过于缓慢,因此探讨联合一种基础性损伤手段--亚致死剂量的x线照射,在该亚致死剂量x线损伤的基础上,通过多次ELF—EMF照射,在肿瘤细胞内反复积聚损伤至临界点时,诱导系统崩溃即细胞凋亡,而正常细胞在ELF-EMF照射间歇内能修复损伤,从而避免损伤的积累。以往对于ELF-EMF的细胞效应机制多局限于其对DNA损伤的研究,没有研究其影响细胞系统的分子网络机制及从系统的高度来阐述其生物效应机制。本研究在基因水平上对其生物效应机制进行分子网络机制的探讨。另外,也探讨一种能与ELF-EMF产生协同抗肿瘤作用的方法,磁性纳米粒子在高频电磁场下的振荡导致细胞内机械损伤可诱导细胞的凋亡,因此它和低频电磁场联用亦能达到增强诱导肝癌细胞凋亡的效果。
　　 本文通过制备磁性纳米粒子、建立ELF—EMF发生装置,利用X线医疗仪器直线加速器以及细胞分子生物学手段,探讨ELF-EMF辐射联用X线辐射和磁性纳米粒子标记这两种手段对肝癌细胞和正常肝细胞的不同的生物效应。观察这种生物效应在肝癌动物模型试验中的应用。并通过基因芯片方法,进一步探讨ELF—EMF特异性影响肝癌细胞的分子网络机制。为判断基因芯片结果的可靠性,选取基因芯片筛选到相关候选基因,观察其他方法鉴定的这些基因表达情况是否与基因芯片结果一致。
　　 结果显示,ELF—EMF联合磁性纳米粒子标记方法能产生协同诱导凋亡效果,而且纳米粒径越小,这种协同诱导细胞凋亡和死亡的效果越明显。在ELF—EMF联用亚致死剂量X线时,ELF—EMF的细胞凋亡效果最为明显,而联用高致死剂量X线时,并不能显著增强凋亡率；而且,EMF和亚致死剂量x线或磁性纳米粒子的联合手段在肝癌细胞中诱导的凋亡率要显著高于肝细胞L—02。同样,ELF—EMF联合亚致死剂量x线(而不是高剂量x线)的选择性杀灭肿瘤细胞的效果在动物试验中也被观察到,该联合治疗组的肝癌动物生存期是最长的。在ELF—EMF影响肝癌细胞的分子网络机制中,发现ELF-EMF在肝癌细胞中主要通过促进细胞周期转移,使来不及修复的DNA损伤带入下代细胞,从而不断积累DNA损伤,表现为DNA修复基因表达数量的增加；且ELF—EMF可导致肝癌细胞线粒体凋亡途径中细胞色素c释放量及促细胞色素c释放基因表达上升,从而促进凋亡。而在ELF—EMF影响肝细胞L—02的分子信号通路中,以上基因的表现正好相反,因此从分子网络机制信号通路上说明了为何ELF-EMF联用亚致死剂量X线和纳米粒子时能促进细胞凋亡,且为何其诱导凋亡效果在肝癌细胞中明显强于正常肝细胞。
　　 在对基因芯片筛选出来的相关凋亡抑制基因选取个别基因如SODD、SURVIVIN、GGT II进行鉴定,证实这些基因在基因芯片中的表达情况与病理组织、病人血清中一致,与免疫组化、RT—PCR和ELISA方法的结果一致,说明了基因芯片的结果可靠性。其中GGT II蛋白的表达在肝癌细胞中被ELF—EMF抑制,与基因表达芯片中该基因mRNA表达被ELF—EMF下调的结果一致。说明以上分子机制假说之基因芯片数据的可靠性。
　　 本研究首次探讨了低频EMF联用低剂量x线以及磁性纳米粒子标记对肝癌细胞所产生的协同作用。并在动物实验中证实了EMF联用低剂量x线对延长动物生存和缩小肿瘤的协同作用。证实了ELF—EMF对癌细胞和正常细胞有着不同的细胞效应。说明EMF联用纳米粒子标记或低剂量x线是一种有潜力的抗肝癌新方法。
　　 本研究首次探讨了ELF—EMF对肝癌细胞和肝细胞的生物效应的分子网络机制；并选取相关基因进行鉴定,证实了基因芯片结果的可靠性。我们因此得出ELF—EMF影响肝癌细胞的假说:ELF—EMF对肝癌细胞的信号通路的影响不同于正常肝细胞,在肝癌细胞中ELF—EMF可促使细胞周期的转换,将其诱导的DNA损伤带入下一代细胞,并不断积累DNA损伤,与此同时,ELF—EMF上调肝癌细胞的色素c释放基因,促进细胞凋亡；而正常细胞中ELF—EMF不能促进细胞周期的转换,相关促周期转换基因被抑制,因此DNA损伤不易带入下一代细胞而得到及时修复,而同时细胞色素c释放基因也被抑制,从而抑制凋亡,故ELF-EMF对正常细胞协同诱导凋亡效应不如肝癌细胞明显。因此从分子网络机制上验证了以上非线性系统理论的假说,即快速膨胀的系统其自稳和自我修复功能不如正常的具有自我约束力的系统,从而使得ELF-EMF能在肝癌细胞内积累损伤并最终诱导其凋亡,而避免对正常肝细胞组织中的损伤。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写注解

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 EMF的宏观生物效应

1.2.1 EMF与肿瘤发生的关系

1.2.2 EMF的抗肿瘤效应

1.2.3 EMF联合磁性纳米粒子的抗肿瘤效应

1.2.4 EMF联合X射线的协同效应

1.2.5 EMF联合Y射线的协同效应

1.3 EMF的微观生物效应

1.3.1 EMF对细胞周期的影响

1.3.2 EMF对细胞凋亡的影响

1.3.3 EMF对信号转导的影响

1.3.4 EMF对DNA和基因的影响

1.3.5 EMF对细胞膜及其形态学参数的影响

1.3.6 EMF对细胞内特定物质的分泌量的影响

1.4 本研究的内容及意义

第二章 EMF联合磁性纳米粒子标记方法及其对肝癌细胞影响

2.1 试剂及仪器

2.2 实验

2.2.1 磁性纳米FeOx的制备及表征

2.2.2 磁性纳米FeOx吸附细胞实验

2.2.3 细胞培养

2.2.4 磁场照射细胞实验

2.2.5 CCK-8细胞增殖实验

2.2.6 细胞凋亡、死亡及周期实验

2.2.7 统计学处理

2.3 结果

2.3.1 纳米FeOx表征实验结果

2.3.2 细胞增殖实验结果

2.3.3 细胞凋亡及死亡实验结果

2.3.4 细胞周期实验结果

2.4 小结

第三章 EMF联合X线作用及对肝癌细胞影响

3.1 实验部分

3.1.1 细胞培养

3.1.2 CCK-8细胞增殖实验

3.1.3 EMF昭射和x线昭射

3.1.4 凋亡检测

3.1.5 EMF增敏X线凋亡

3.1.6 比较不同次数EMF暴露的增敏凋亡作用

3.1.7 BEL-7402细胞DNA倍体的流式细胞仪分析

3.1.8 EMF暴露对BEL-7402细胞DNA结构模式的影响

3.1.9 肝癌小鼠模型制作

3.1.10 小鼠肝癌模型的EMF增敏x线治疗方案

3.1.11 EMF次数增加对肝癌模型的影响

3.1.12 统计学分析

3.2 结果

3.2.1 肝癌细胞BEL7402与正常肝细胞L-02的形态学

3.2.2 EMF对肝癌细胞增殖的影响

3.2.3 EMF对肝癌细胞DNA倍体峰变化的影响

3.2.4 EMF增敏肝癌细胞X线凋亡

3.2.5 不同次数EMF增加肝癌细胞凋亡率

3.2.6 比较不同4GyX线＋EMF2次对BEL7402肝癌细胞和肝细胞L-02的凋亡作用

3.2.7 暴露于EMF/x线的肝癌-小鼠的生存时间

3.2.8 在4Gy x线照射基础上不同次数EMFs照射的小鼠生存时间及肿瘤大小

3.3 小结

第四章 基因芯片技术探讨EMF之肝癌细胞生物效应的可能分子机制

4.1 材料

4.1.1 细胞株

4.1.2 芯片

4.1.3 肝癌及癌旁组织

4.1.4 主要试剂

4.1.5 主要仪器

4.2 实验

4.2.1 细胞培养

4.2.2 表达谱芯片实验

4.2.3 筛选抗凋亡相关的差异表达基因

4.2.4 半定量RT-PCR检测mRNA水平

4.2.5 免疫组化在病理组织中检测蛋白

4.2.6 DSA-Sepharose 4B凝集素亲和层析法在病人血清中检测GGTⅡ同工酶

4.2.7 DSA亲和层析法分析GGTⅡ在肝癌病人血清及非肝癌人群血清的阳性率

4.2.8 GGT Ⅱ单克隆抗体的制备及血清GGTⅡ检测ELISA试剂盒的建立

4.2.9 ELISA法检测GGTⅡ在肝癌病人血清及非肝癌人群血清的阳性率

4.2.10 鉴定EMF昭射对肝癌细胞GGTⅡ蛋白表达的影响

4.2.11 统计方法

4.3 结果

4.3.1 基因芯片图像及杂交信号强度散点图

4.3.2 EMF影响肝癌细胞与肝细胞的基因表达谱模式

4.3.3 RT-PCR鉴定SODD以及SURVIVIN的mRNA表达在多株肝癌细胞株中高于肝细胞

4.3.4 临床病理组织中鉴定SODD及SURVIVIN的蛋白表达在肝癌组织中高于癌旁非肝癌肝组织

4.3.5 亲和层析法鉴定肝癌病人血清GGTⅡ的含量高于非肝癌病人血清

4.3.6 亲和层析法鉴定GGT Ⅱ蛋白在肝癌病人中的阳性率高于非肝癌人群

4.3.7 ELISA方法鉴定GGT Ⅱ蛋白在肝癌病人中的阳性率高于非肝癌人群

4.3.8 在肝癌细胞株中鉴定GGTⅡ蛋白在EMF照射后表达下降

4.3.9 生物信息学分析基因芯片数据推论EMF之肝癌细胞生物效应的可能分子网络机制

4.4 小结

第五章 讨论

第六章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 主要创新点

6.3 将来工作的展望

参考文献

致谢

攻读学位期间主要研究成果目录