不同浓度的17β-雌二醇对心肌细胞H9c2细胞内游离离子稳态的影响及机制研究

摘要

自上世纪以来的流行病学研究表明,心血管疾病的发病率和死亡率存在着性别差异。绝经前女性心血管疾病的发病率明显低于同龄男性。而且,不管是由于自然的因素还是外科手术抑或是卵巢功能受损从而导致雌激素分泌的停滞,都会使女性患心血管疾病的危险性增加。女性心脏疾病的发病比男性平均晚10年,绝经后妇女心血管疾病的发病率是同龄的绝经前妇女的4倍以上。雌激素水平下降是绝经后妇女最主要的生理变化。实验研究证实,天然雌激素如17β-雌二醇可直接作用于心脏或影响血管系统从而对心血管疾病的发生产生影响。近年来研究认为雌激素可通过防止动脉硬化形成和血管重塑而起保护作用,包括雌激素的抗凋亡、抗氧化,改变脂蛋白代谢、血小板的粘附和聚集,血管内皮激活一氧化氮合成从而导致血管舒张,抑制心肌肥大和减少心肌缺血等。因此,男性与绝经前同龄女性之间心血管疾病的发病率和死亡率之间的差异主要是由于雌激素的保护作用。然而,绝经后女性大样本随机临床试验的研究表明雌激素和孕激素的联合使用结果对激素替代的心血管保护作用提出了质疑,认为激素替代不仅不对心血管有保护作用,反而增加心血管疾病的发病率和死亡率,引起心脏疾病、乳腺癌、脑血栓和痴呆等发病的危险性。这些有关雌激素对心血管作用负面研究结果引发了人们对激素替代治疗的质疑。为更好地解决激素替代治疗引发的公共卫生危机,关键是弄清楚雌激素对心血管系统的快效应和慢效应的复杂机制,因此需要对雌激素的正效应和负作用进行全面评估。雌激素对血管系统的作用已有较全面的认识,但对心脏的直接作用还知之甚少。近年来,研究的焦点已开始从血管系统转向心肌细胞。一般认为,细胞内离子稳态对维持心肌细胞的正常功能起着重要的作用,心脏正常的收缩功能有赖于心肌细胞离子稳态和激活一收缩耦联。雌激素对心肌细胞离子通道的瞬时效应已有广泛的研究,然而对其长期效应却知之甚少,因此阐明雌激素影响心肌细胞内离子稳态作用机制是十分必需的。
　　 在我们以往的研究中,利用cDNA微阵列技术观察到:去势3个月后,左室心肌细胞的上百个基因的表达发生改变,其中包括Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、碳酸酐酶、L型钙通道蛋白、延迟整流钾通道蛋白和电压门控钠通道蛋白以及Na+-H+交换蛋白和Na+-Ca2+交换蛋白等的表达。心肌细胞电解质稳定对其功能发挥起至关重要的作用。对心肌细胞H9c2的研究发现生理浓度的雌激素能上调Na+,K+-ATP酶、肌浆网Ca2+-ATP酶和碳酸酐酶的表达和活性,这些酶均可能参与细胞内外电解质平衡的调节。上述的实验结果提示,生理浓度的雌激素水平可能维护心肌细胞内的离子浓度、pH值和膜电生理等特性而保护心肌细胞;否则,会导致电解质紊乱、电生理异常、心肌细胞损伤乃至死亡。因此,本研究的目的是寻找雌激素对心肌细胞内游离离子稳态影响的直接证据。我们用鼠H9c2心肌细胞为研究对象,检测不同浓度雌激素对细胞内Ca2+、Na+、K+、H+和Cl-等离子浓度和Ina、Ica,L、Ik等离子电流的影响。
　　 第一章、17β-雌二醇对心肌细胞H9c2内游离离子浓度的影响
　　 目的：研究不同浓度的17β-雌二醇对心肌细胞H9c2内Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等游离离子浓度的影响。
　　 方法：Hgc2心肌细胞分别在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)条件下培养24小时,接着分别用荧光探针Fluo-3,SBFI,PBFI,SNARF-1,MQAE孵育细胞,用荧光法测定细胞内游离离子(Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-)浓度。
　　 结果：心肌细胞H9c2分别在0、0.01 aM、1 aM、100 nM、1000 nM17β-雌二醇中培养24小时后,心肌细胞内的游离钙离子浓度分别是(157.5±5.7)nM,(153.8±6.2)nM,(148.5±8.7)nM,(144.5±7.8)nM,(167.5±9.0)nM。实验结果显示:与无17β-雌二醇组相比,0.01nM、1 nM和100 nM17β-雌二醇组的细胞内[Ca2+]下降(p＜0.05)。无E2组和0.01 nM E2组细胞内[Ca2+]显著高于1 nM E2组(p＜0.05)。1 nm和100 nM17β-雌二醇组之间细胞内[Ca2+]无显著性差别(p＞0.05),而1000 nM17β-雌二醇组细胞内[Ca2+]却比无E2组和0.01 nME2组,1nM E2组和100nM E2组有显著性升高(p＜0.05)。
　　 结论：研究表明1nM和100 nM的17β-雌二醇能维持H9c2细胞内Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等离子的浓度在生理浓度范围,1 nM和100 nM17β-雌二醇组间细胞内离子浓度无显著性差异。H9c2细胞在无E2、0.01 nME2或1000 nM E2条件下,细胞内游离离子平衡出现紊乱。因此,17β-雌二醇对H9c2细胞内Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等游离离子浓度的稳定起着至关重要的调节作用。
　　 第二章、17β-雌二醇对H9c2心肌细胞的电压门控钠电流、L型钙电流、延迟整流钾电流等离子通道电流的影响
　　 目的：研究不同浓度的17β-雌二醇对H9c2心肌细胞的电压门控钠电流(Ina)、L型钙电流(Ica,L)、延迟整流钾电流(Ik)等离子通道电流的影响。
　　 方法： H9c2心肌细胞分别在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)条件下培养24小时,用全细胞膜片钳技术测定H9c2细胞的电压门控钠电流(Ina)、L型钙电流(Ica,L)、延迟整流钾电流(Ik)等离子通道电流。
　　 结果：电压依赖的Ina的测定:维持电位(holding potential)为-80mV,每隔10mV,连续除极至20mV。内向Ina大约在-70mV出现,在-30mV达到最大,而在+20mV逆转。用0、0.01 nM、1 nM、100 nM、1000nM E2处理H9c2细胞24h后,其平均最大Ina分别是(3.61±0.42)(pA/pF),(2.80±0.29)(pA/pF),(2.27±0.30)(pA/pF),(2.08±0.31)(pA/pF),(1.51±0.20)(pA/pF)。与无E2组相比,0.01 nM、1 nM、100 nM、1000 nM E2处理组的平均最大Ina有显著性下降(p＜0.05),17β雌二醇能以浓度依赖的方式抑制Ina。另外,17β-雌二醇不改变Ⅰ-Ⅴ曲线(n=12-16)。
　　 结论：用0、0.01 nM、1 nM、100 nM和1000 nM E2处理H9c2细胞24h后,Ina、Ica.L、IK随17β-雌二醇浓度升高而降低。研究表明电压门控钠电流(Ina)、L型钙电流(Ica,L)、延迟整流钾电流(Ik)等离子通道电流以浓度依赖的方式随17β-雌二醇浓度升高而降低。
　　 第三章、不同浓度的17β-雌二醇对心肌细胞H9c2细胞形态、损伤及死亡程度的影响
　　 目的：研究不同浓度的17β-雌二醇对心肌细胞H9c2细胞形态及损伤程度的影响。
　　 方法： H9c2心肌细胞分别在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)条件下培养24小时,接着分别用荧光探针Fluo-3,SBFI,PBFI,SNARF-1,MQAE孵育细胞,用激光扫描共聚焦显微镜进行细胞形态观察。通过释放到培养基的LDH活性测定和PI染色细胞观察17β-雌二醇对细胞损伤和细胞死亡的影响。
　　 结果：将H9c2与不同的荧光探针孵育后,用激光共聚焦显微镜进行形态学观察,发现在无E2或在1000 nM E2时有细胞形态学的改变,细胞变得平而圆。心肌细胞H9c2分别在0、0.01 nM、1 nM、100 nM、1000nM17β-雌二醇中培养24d,时后,细胞培养基中LDH释放率分别是(11.9±1.1)％,(11.4±1.5)％,(10.2±0.9)％,(9.94±1.6)％,(13.4±1.7)％。无E2组和0.01 nM E2组之间,培养基中LDH释放率无显著性差异(p＞0.05),而1nME2组和100 nM E2组中LDH释放率显著低于无E2组和0.01nM E2组(p＜0.05)。但1 nM E2和100 nM E2组之间无显著性差异(p＞0.05)。1000 nM E2组的H9c2细胞LDH释放率都显著性的高于无E2组,0.01 nM E2组,1 nM E2组和100 nM E2组(p＜0.05)。
　　 结论：研究表明H9C2细胞在无E2、0.01 nM E2或1000 nM E2条件下,有细胞形态学的改变,并引起细胞损伤和细胞死亡的增加。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 17β-雌二醇对心肌细胞H9c2内游离离子浓度的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二章 17β-雌二醇对H9c2 心肌细胞的电压门控钠电流、L型钙电流、延迟整流钾电流等离子通道电流的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章 不同浓度的17β-雌二醇对心肌细胞H9c2细胞形态、损伤及死亡程度的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

综述 激素替代治疗：回顾与展望

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