肌细胞增强因子2A基因突变调控血管平滑肌细胞机制及干预研究

摘要

目的：
　　 本研究通过构建MEF2A野生型(WT)、MEF2A显性负突变型(△21)及MEF2A siRNA的VSMCs细胞模型，观察MEF2A基因突变对VSMCs增殖、迁移、表型和MAPK信号通路的影响。再观察阿托伐他汀对这些MEF2A基因突变影响的干预作用。分别探讨MEF2A基因突变与CHD的相关性和阿托伐他汀可能的非调脂抗动脉粥样硬化机制。
　　 方法：
　　 1、建立MEF2A基因突变的血管平滑肌细胞模型
　　 用带双抗（青霉素和氯霉素，浓度为100单位/ml）含10％胎牛血清(FBS)的D/F培养基培养人主动脉平滑肌细胞(VSMCs)，每5天用0.25％胰蛋白酶消化传代。显微镜下观察细胞形态学以及Western blotting检测α-SM-actin，鉴定VSMCs性状。将VSMCs随机分为四组，参照EntransterTM-D和EntransterTM-R纳米聚合物转染试剂转染试剂使用说明进行转染：(1)对照（空白）组：转染绿色荧光蛋白(GFP)质粒，即pc-DNA3.1(＋)-GFP质粒；(2)WT组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)质粒；(3)△21组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21碱基缺失型(△21)质粒；(4)siRNA组：转染MEF2AsiRNA。瞬时转染质粒和siRNA进VSMCs。MEF2A质粒均带有Flag标签，转染24小时后，通过Western blotting检测Flag蛋白表达，以确认MEF2A质粒转染成功，并观察对照组细胞内GFP荧光表达估算转染效率。转染48小时后，Western blotting测定对照组、WT组、△21组和siRNA组VSMCs细胞内MEF2A蛋白表达，验证MEF2A基因突变的VSMCs细胞模型成功建立。
　　 2、MEF2A基因突变对血管平滑肌细胞的影响
　　 将VSMCs按转染质粒分为四组：(1)对照（空白）组：转染pc-DNA3.1(＋)-GFP质粒；(2)WT组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)质粒；(3)△21组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21碱基缺失型(△21)质粒；(4)siRNA组：转染MEF2AsiRNA。应用EntransterrM-D和EntransterrM-R纳米聚合物转染试剂，瞬时转染质粒和siRNA进VSMCs。
　　 2.1测定VSMCs增殖变化：转染24小时后，静息培养细胞24小时，消化收集后以每孔5×104的密度接种于96孔板，每组VSMCs设3批，每批5复孔。用含10％胎牛血清的D/F培养基正常培养细胞。继续培养各组细胞第1批24小时，第2批48小时，第3批72小时后，给每孔加入溴化噻唑基蓝四唑(MTT)溶液(5mg/ml)20μl，维持培养4小时后终止培养。吸弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，全波段酶标仪测定各孔的570nm OD值。
　　 2.2测定VSMCs迁移变化：Millicell下室加入500ul含10ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF)-BB的无血清培养基。转染24小时后，静息培养细胞24小时，消化收集后用含0.1％胎牛血清的培养基制成5×105/ml细胞悬液，接种于Millicell上室，每孔200ul细胞悬液。继续培养12小时后，用棉签擦除Millicell上室内复合碳酸膜膜面上层的VSMCs，将膜面下层的细胞HE染色，计算迁移的VSMCs数。
　　 2.3测定VSMCs表型变化以及p38和ERK1/2信号通路：转染48小时后，用Protease inhibitors细胞裂解液冰上充分裂解细胞。于4℃，12000转/分，离心10分钟后取上清液，运用SDS-PAGE和Westernblotting法来测定上清液中α-SM-actin、SM22α、OPN、p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平。
　　 3、阿托伐他汀干预对MEF2A基因突变的血管平滑肌细胞的影响将VSMCs按转染质粒分为三组：(1)WT组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)质粒；(2)△21组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21碱基缺失型(△21)质粒；(3)他汀组：转染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21碱基缺失型(△21)质粒。应用EntransterTM-D纳米聚合物转染试剂，瞬时转染质粒和siRNA进VSMCs。
　　 3.1测定VSMCs增殖变化：转染24小时后，静息培养细胞24小时，消化收集后以每孔5×104的密度接种于96孔板，每组VSMCs设3批，每批5复孔。用含10％胎牛血清的D/F培养基正常培养细胞，并向他汀组培养孔内加入阿托伐他汀溶液至终浓度100μmol/L。继续培养各组细胞第1批24小时，第2批48小时，第3批72小时后，给每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，维持培养4小时后终止培养。吸弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，全波段酶标仪测定各孔的570nm OD值。
　　 3.2测定VSMCs迁移变化：Millicell下室加入500μl含10ng/mlPDGF-BB的无血清培养基。转染24小时后，静息培养细胞24小时，消化收集后用含0.1％胎牛血清的培养基制成5×105/ml细胞悬液，接种于Millicell上室，每孔200ul细胞悬液，并向他汀组上室加入阿托伐他汀溶液至终浓度100μmol/L。继续培养12小时后，用棉签擦除Millicell上室内复合碳酸膜膜面上层的VSMCs，将膜面下层的细胞HE染色，计算迁移的VSMCs数。
　　 3.3测定VSMCs表型、p38和ERK1/2信号通路：转染24小时后，向△21他汀组加入阿托伐他汀溶液至终浓度100μmol/L。继续培养24小时，用Protease inhibitors细胞裂解液冰上充分裂解细胞。于4℃，12000转/分，离心10分钟后取上清液，运用SDS-PAGE和Westernblotting法来测定上清液中α-SM-actin、SM22α、OPN、p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平。
　　 结论：
　　 1.选用带双抗含10％FBS的D/F培养基，可成功培养人VSMCs。
　　 2.构建MEF2A显性负突变基因质粒，采用瞬时转染方法转染进VSMCs，是建立MEF2A显性负突变突变基因的细胞模型一种有效方法。
　　 3.瞬时转染MEF2A siRNA可以有效阻断MEF2A基因表达。
　　 4.MEF2A基因显性负突变及沉默使VSMCs增殖和迁移能力增加。
　　 5.MEF2A基因显性负突变及沉默可使VSMCs由收缩型向合成型转化。
　　 6.p38和ERK1/2 MAPK信号通路参与了MEF2A基因突变对VSMCs的作用。
　　 7.阿托伐他汀可抑制MEF2A基因突变诱导的VSMCs增殖和迁移。
　　 8.阿托伐他汀可抑制VSMCs的表型转化。
　　 9.阿托伐他汀可通过p38和ERK1/2 MAPK信号通路抑制MEF2A基因突变对VSMCs的诱导作用。