东乡野生稻cDNA文库构建及有利基因筛选

摘要

野生稻中含有丰富的有利基因，尤其是抗病虫，抗寒耐旱方面性状突出，但由于生殖隔离及遗传背景知识匮乏等限制，使传统杂交育种及常用的抗性基因克隆方法都难以在野生稻中利用。本课题将野生稻基因导入酵母中，利用酵母突变体功能互补技术挖掘野生稻有利基因。
　　 本课题研究的材料为东乡野生稻(2n＝24)，它是世界纬度最北(位于东经116°36′，北纬28°14′)的普通野生稻，它在－12.8～0℃低温条件下仍能安全越冬，具宿根（多年生），再生力和繁殖（无性）力强，耐旱、耐贫瘠及多种抗逆性等各种有利性状及含胞质不育基因、广亲和基因、恢复基因、抗病虫基因等多种有利基因。
　　 从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA，以总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶转录合成第一链，LDPCR扩增后，将获得的双链cDNA与构建的酵母表达载体YPL3连接，成功构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为4.4×10′cfu/ml；挑取16个单克隆，SfiⅠ酶切后测得平均插入片段约1kb，重组率为100％，符合cDNA文库构建要求，为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。利用酵母功能互补技术对cDNA文库进行了抗寒基因和磷高效利用基因筛选，筛选中用的酵母宿主菌是磷缺陷型菌株MB192和温度敏感型菌株Y187。