基于与转运蛋白P-gp相互作用的抗结核药物耐药机制研究

摘要

20世纪80年代后结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，其主要原因之一是耐药菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的出现。结核杆菌的高耐药问题已成为新世纪结核病控制的难题之一。目前对耐多药结核(MDR-TB)耐药机制的研究主要集中在耐多药分枝杆菌领域，较少从宿主角度考虑。结合抗肿瘤多药耐药机制的研究成果--即肿瘤多药耐药的发生主要是由于P-gp等转运蛋白对药物产生了外排作用。本课题通过分子生物学实验和动物实验两部分研究，从宿主的角度考察了不同抗结核药物在体外对P-gp的影响，以及抗结核药物不同组合在不同给药周期条件下在体内对药物的组织分布和不同组织mdr1α mRNA表达水平的影响。
　　 目的：通过考察治疗剂量的五种抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)和左氧氟沙星(LVX)对Caco-2细胞上P-gp功能和表达的影响，探讨四种主要抗结核药物与P-gp是否存在明显相互作用；以此为基础进一步选择三种抗结核药物研究不同组合对药物在昆明小鼠不同组织分布，以及对小鼠各组织mar1α mRNA表达水平的影响，初步探讨宿主因素对抗结核药物耐药的影响，以及临床抗结核治疗标准给药方案的潜在耐药因素。
　　 方法：
　　 1.细胞模型的建立及细胞毒性试验采用人结肠癌细胞(Caco-2)、脐静脉内皮细胞(ECV304)，为四种抗结核药物对P-gp功能和表达的作用研究提供P-gp载体细胞和阴性对照细胞。ECV304和Caco-2细胞均采用MEM培养基进行常规培养；细胞免疫荧光法进行细胞膜上P-gp表达验证。
　　 采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)，判断各试验药物的体外最大非细胞毒性剂量，保证试验过程中细胞的活性，并为四种抗结核药物对P-gp功能和表达的研究提供与细胞作用的安全浓度。
　　 2.罗丹明-123摄取实验研究药物对Caco-2细胞P-gp功能的影响以ECV304细胞作阴性对照细胞，采用流式细胞仪测定细胞内荧光强度，以RFP作为P-gp功能诱导的阳性对照，维拉帕米(VER)作为P-gp功能抑制的阳性对照，分别考察四种抗结核药物对经典P-gp功能探针药物--罗丹明-123(Rh-123)摄取作用的影响，以此判断P-gp功能的变化。
　　 3.流式细胞术检测药物对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响以RFP作为P-gp表达上调的阳性对照，VER作为P-gp表达下调的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用流式细胞术(FCM)分别分析四种抗结核药物对Caco-2细胞上P-gp表达的影响。
　　 4.实时荧光定量PCR检测药物对Caco-2细胞MDR1 mRSA表达以RFP作为MDR1 mRNA上调的阳性对照，VER作为MDR1mRNA下调的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用实时荧光定量PCR技术分别分析四种抗结核药物对Caco-2细胞MDR1 mRNA表达水平的影响。
　　 5.LC-MS/MS法测定昆明鼠血浆及各组织中三种抗结核药物的浓度采用C4色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm，Welch materials，USA)，流动相为0.05％甲酸溶液-甲醇(v/v)梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，柱温25℃，进样量20μL，采用ESI+多反应选择离子检测(MRM)。
　　 6.三种抗结核药不同给药组合与不同给药周期条件下在昆明鼠的血浆和组织分布情况昆明鼠168只，分为A组(空白组)、B组(INH alone组)、C组(RFP alone组)、D组(LVX alone组)、E组(INH+RFP组)、F组(LVX+RFP组)、G组(RFP+INH+LVX组)，每组24只，并随机编号。腹腔注射给药，每日1次，给药体积为0.2ml，空白组给注射生理盐水0.2ml，各药物组给药量分别为INH(45mg·kg-1)，RFP(67.5mg·kg-1)，LVX(45 mg·kg-1)。于第1次给药后2小时，各组动物取一半，分别眼眶取血后处死小鼠，快速摘取脑、肝、肾、肺、小肠等组织，全血采用肝素抗凝，6000 r·min-1离心10min后分离血浆，编号后于-70℃冰箱保存待测，组织样本经生理盐水洗净后，称重，装于小封口袋，编号后于-70℃保存待测；于第10次给药后2小时，分别处死各组剩余动物，分别采集上述样本待测。通过测定血浆及各种组织中在给药2h时的药物浓度加以分析。
　　 7.三种抗结核药不同给药组合连续给药10d对昆明鼠不同组织mdr1α mRNA表达水平的影响昆明鼠21只，体重30g左右。小鼠购回后均饲养3d适应新环境，按完全随机设计分成7组，每组3只。分组及给药方法“同上”。在第10d给药后2 h将小鼠放血处死，快速取出脑、肺、肾、小肠组织，编号后置于液氮中保存待测。各器官组织样本进行RT-PCR检测分析。
　　 结果：
　　 1.Caco-2细胞和ECV304细胞在正常条件下生长旺盛；Caco-2细胞P-gp高表达，可用于研究四种抗结核药物对P-gp功能和表达的影响；ECV304细胞P-gp低表达，适合作为阴性对照细胞。MTT结果显示五种抗结核药及VER带药培养3d，对Caco-2细胞的最大无毒浓度分别为：RFP100μmol/L，INH150μmol/L，LVX5μmol/L，EMB150μmol/L，PZA2001μmol/L，VER101μmol/L。在后续10d、20d、30d、40d、50d MTT实验中选择药物的浓度分别为：RFP10μmol/L，INH80μmol/L，LVX2μmol/L，EMB301μmol/L，PZA100μmol/L(各药物浓度均接近人常规剂量给药后的血药峰浓度)；VER为10μmol/L。最终的MTT结果显示：各细胞存活率均大于90％。因此，各药物浓度适用于研究长期含药培养对P-gp功能和表达的影响。
　　 2.各研究药物对Caeo-2细胞P-gp功能的影响：药物干预1h时，四个抗结核药物组、阳性诱导对照组(RFP)及阳性抑制对照组(VER)均明显减少了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P<0.05)，揭示瞬时的药物刺激能增强P-gp的外排功能，对干预药物不具选择性。药物干预3d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均明显增加了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P<0.05)，说明随着短期内药物干预时间延长，药物干预转为减弱P-gp的外排功能，同样对干预药物不具选择性。药物干预10d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组对P-gp的外排功能表现出差异，其中RFP、INH与EMB减少了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P<0.05)，增强了P-gp的外排功能，表现出诱导作用；VER和LVX增加了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P<0.05)，减弱了P-gp的外排功能，表现为抑制作用；而PZA与阴性对照组比较无显著性差异。药物干预20d时，各药物组与阳性对照组对Rh-123在Caco-2细胞内的影响与干预10d时的结果趋势一致。药物干预30d时，各药物组与阳性对照组对Rh-123在Caco-2细胞内的影响与药物干预10d和20d时的结果趋势仍表现一致；其中VER和LVX仍表现为抑制作用(P<0.05)，但其增加Caco-2细胞内Rh-123蓄积的相对量有所下降；INH、EMB和RFP仍表现为诱导作用(P<0.05)。药物干预40d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均明显减少了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P<0.05)，全部表现为诱导作用；且药物干预50d时，各药物组及阳性对照组与药物干预40d时结果一致，也全部表现为诱导作用。
　　 3.各研究药物对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响：药物干预1h时，四个抗结核药物组、阳性诱导对照组(RFP)及阳性抑制对照组(VER)分别与阴性对照组比较，P-gp的表达量差异均没有统计学意义，说明瞬时(1h)的药物干预对P-gp的表达量几乎没有影响；药物干预3d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均下调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P<0.05)，各组的P-gp表达量仅为阴性对照组的40％左右，说明短期(3d)的药物干预，可较明显的抑制P-gp的表达，且这一过程对干预药物不具明显的选择性。药物干预10d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组对Caco-2细胞上P-gp的表达量表现出差异，其中INH组和EMB组的P-gp表达量与阳性诱导对照组(RFP)一致，约为阴性对照组的4～7倍，表现出诱导作用；LVX组与阳性抑制对照组(VER)一致，其P-gp表达量约为阴性对照组的30％，表现出抑制作用；而PZA与阴性对照组比较无显著性差异。药物干预20d时，各药物组及阳性对照组对Caco-2细胞上P-gp表达量的影响与干预10d时的结果趋势一致，其中INH组租EMB组P-gp表达量约为阴性对照组的4倍，LVX组P-gp的表达量约为阴性对照组的50％，而PZA与阴性对照组比较无显著性差异。药物干预30d、40d、50d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均明显增加了Caco-2细胞上P-gp的表达量(P<0.05)，表现出不具药物选择性的诱导作用。
　　 4.各研究药物对Caco-2细胞MDR1 mRNA表达的影响：药物干预1h时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组与阴性对照组比较，MDR1mRNA的表达量差异没有统计学意义。药物干预3d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均下调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P<0.05)，各组的MDR1 mRNA表达量仅为阴性对照组的30％左右。药物干预10d时，INH、EMB及阳性诱导对照组RFP均上调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P<0.05)，其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表达量为阴性对照组的12倍左右，为阳性诱导组RFP的90％；LVX与阳性抑制对照组VER一致，下调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P<0.05)，其MDR1 mRNA表达量约为阴性对照组的30％；而PZA与阴性对照组比较无显著性差异。药物干预20d时，各药物组及阳性对照组对Caco-2细胞上MDR1 mRNA表达量的影响与干预10d时的结果趋势一致。药物干预30d时，四个抗结核药物组、RFP组及VER组均上调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P<0.05)，表现出不具药物选择性的上调作用；且药物干预40d和50d时，各药物组与阳性对照组与干预30时结果趋势一致，同样表现出不具药物选择性的上调作用。总体上，各研究药物在各时间周期对MDR1 mRNA表达的影响与对P-gp蛋白表达的影响趋势基本一致。
　　 5.LC-MS/MS法测定昆明鼠血浆及不同组织中三种抗结核药物的浓度：所建立的LC-MS/MS法专属性强、灵敏准确，适用于同时测定血浆和组织样本中INH、RFP和LVX的浓度。
　　 6.三种抗结核药不同给药组合与不同给药周期条件下在昆明鼠的血浆和组织分布结果：各给药组在血浆中的药物浓度均表现为连续给药10d明显比单次给药高；而各给药组在脑、肝、肾组织的药物分布，表现为连续给药10d药物浓度均明显低于单次给药，并且LVX能明显拮抗所合用药物组织分布减少的趋势。各给药组在小肠组织的药物分布，则表现为给药10d药物浓度与单次给药无明显差异。
　　 7.三种抗结核药不同给药组合连续给药10d对昆明鼠不同组织mdr1α mRNA表达水平的影响：对比空白组，同一药物试验组连续腹腔注射给药10d后对小鼠不同组织mdr1α mRNA影响不同，而不同药物试验组对小鼠同一组织mdr1α mRNA的影响也不同；总体趋势为INH组、RFP组、INH+RFP组均能明显上调小鼠脑、肾和小肠组织的mdr1α mRNA水平，尤其是对脑组织和小肠组织中mdr1α mRNA水平的上调幅度达到5-70倍，对肾组织也达到8-12倍；而LVX则表现为下调小鼠脑和肾组织的mdr1α mRNA水平，倍数为0.8-0.9，且LVX+RFP组较RFP组以及RFP+INH-LVX组较INH+RFP组对小鼠脑、肾和小肠组织的mdr1α mRNA水平上调程度均有显著降低；但各药物组对肺组织mdr1α mRNA水平均表现为下调趋势，这可能与肺组织本身P-gp分布较少有关，肺组织仅在其分泌细胞有P-gp分布，而本实验是测定的全肺组织，因此其整体mdr1α mRNA水平较低，药物对其影响则不明显。
　　 结论：
　　 1.体外细胞试验初步证实INH和EMB为P-gp的诱导剂，INX为P-gp的抑制剂，PZA与P-gp无明显的相互作用。并发现长期药物干预时(>30d)，对Caco-2细胞上P-gp的功能和表达的影响表现出无药物选择性的上调作用，有待进一步证实。
　　 2.动物实验发现，长期用药(10d)过程中，不同药物组合对药物的组织分布以及组织mdr1α mRNA表达水平存在明显影响，整体趋势为上调组织mdr1α mRNA表达水平，降低药物的组织分布，但含有LVX的组合对这一现象具有明显拮抗作用。
　　 3.结合细胞实验和动物实验，初步证实抗结核治疗长期用药会上调P-gp的功能和表达以及MDR1/mdr1α mRNA表达水平，从而使组织药物浓度降低，这可能是抗结核药物产生耐药的重要机制之一。