支架磁感应热疗食管肿瘤的实验研究

摘要

研究背景:癌症是严重威胁人类健康的疾病之一，国际癌症研究机构GLOBOCAN估计，2008年癌症新发病例为1270万，死亡病例为760万。其中，56％的新发病例和64％的死亡病例发生于发展中国家。据统计，发病率第一位的是肺癌，其后是乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肝癌。随着人口不断的增长和老龄化，即使以当前的发病率和死亡率计算，全世界的癌症人口将不断增加。WHO估计到2030年，因癌症死亡病例将增加72％，死亡病例数将从760万增加到1300万人[1]。
　　当前恶性肿瘤最有效的治疗手段仍是传统的手术、放射线照射和化学药物治疗三大方面，随着科技的进步和研究的深入我们也看到了一些新的治疗方法，如:免疫治疗、基因治疗、单克隆抗体治疗等等，但这些方法目前还不成熟，且费用昂贵，尚无法在临床上大规模应用。当前的主要治疗手段本身又有局限性，手术只能应用于肿瘤范围局限，对很多中晚期病例无能为力，并且手术可能带来组织器官的缺损，严重影响患者的生活质量。放射和化学治疗对于全身的损害显而易见，即便如此，很多病例的治疗效果相当有限，多种治疗手段综合应用，针对每个个体疾患的不同特点应用最适当的治疗方案是目前肿瘤防治的共识。
　　人们早在一百多年前就认识到加热可以治疗肿瘤，目前热疗仍是综合治疗手段中常应用的一种行之有效的治疗方法，相对于放化疗，它的应用次数不受限制，对于放化疗抵抗的肿瘤，热疗仍然有效。但其本身有局限性，第一、加热的温度难以精确控制;第二、正常组织的耐受温度和恶性肿瘤的杀伤温度相当接近，限制热疗温度的提高;第三、由于组织对热有较好的传导性，即便是区域性的加热，也难以有效的控制其加热的范围，从而导致正常组织的损伤。第四、目前的技术手段尚难以保证治疗区域内温度的均一性，影响其治疗效果。如何精确热疗是目前研究的热点内容。其中微波相控阵原理研制的BSD-2000精确热疗系统已经进入临床，成为肿瘤治疗又一新的有效治疗手段。
　　但无论是微波或是射频热疗，其本身还是有一定的局限性的，它们采用的是高频电磁场，因此，人体表层的软组织特别是皮下脂肪组织可以大量吸收它们的能量，这导致它们穿过人体时能量大幅衰减，这使得很早就已经开发出来的很多热疗设备如微波、射频、红外线等，只限于皮肤表层肿瘤的热疗，对于深层组织的热疗却无能为力。我们知道中低频的电磁场是可以穿过人体而很少发生能量衰减的，这是这一频段电磁场的优势，也是它的问题，因为，它无法将能量有效的传递给靶组织，不能起到热疗的效果。但如果在靶组织内有金属导体，那情况就大不相同了，根据电感的原理，处于交变电磁场中的金属导体或磁性介质能发热，那么，如果在深部靶组织中植入相应的导体或磁性介质，外部施加以中低频的交变磁场，一种新型的深部靶向热疗的技术就形成了。
　　基于这一设想，国内外开发了很多感应性加热设备，应用于实验和临床研究，取得了可喜的成果，特别是德国JordanA等于2004年开发完成MFH(R)300F中频热疗系统，使磁感应性加热进入实用化的新阶段[2]。紧跟这一潮流，本实验室于2003年开始类似设备的研发。2008年研制成功国内第一台磁感应加热临床样机，填补了国内的空白。本实验就是以这台临床样机为基础，对其磁感应加热特性、应用参数及产生的生物学效应进行了一系列的细胞与动物研究。
　　第一部支架磁感应热疗对人类食管癌细胞系ECA-109的体外研究
　　第一节支架磁感应热疗的温度实现
　　目的：探讨在临床机下，温度可重复性的实验参数及条件。
　　方法：采用循环水浴提供恒定的实验环境温度，对磁极位置进行精确的定位，并使支架处于磁场于同一位置，以支架浸没于培养液冻存管的条件下，测定支架达到设定温度并维持平衡所需的磁场参数及时间，以相同条件的水浴加热作对照，两加热组每个设定温度复重6次，热电偶测温并获取两组加热的升温曲线。
　　结果：通过应用不同的磁场参数，所应用的金属支架可以在交变磁场中良好升温，3个设定的温度均能快速达到，并能长时间维持平衡。43℃、48℃、53℃所应用的参数分别为:磁芯间隙360mm，初始应用电流45A，80sec转为15A维持;磁芯间隙360mm，初始应用电流45A，140sec转为16A维持;磁芯间隙240mm，初始应用电流45A，160sec转为20A维持。水浴加热升温43℃、48℃、53℃达到平衡温度的时间分别为160sec、170sec、180sec。
　　结论：金属支架在本临床机施加的磁场中升温性能良好，设定的温度能快速达到且长时间维持平衡。
　　第二节支架磁感应热疗对人类食管癌细胞系ECA-109形态、增殖和凋亡的影响
　　目的：研究不同温度支架磁感应热疗对食管癌ECA-109细胞形态、增殖和凋亡的影响。
　　方法：对ECA-109细胞行43℃、48℃、53℃支架磁感应和水浴热疗，并与正常培养和支架磁感应加热对应磁场作用为对照。倒置显微镜下观察热疗后不同时间点细胞形态的变化;MTT法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞的凋亡率及坏死率;TUNEL免疫细胞化学凋亡染色对细胞凋亡形态进行观察。
　　结果：与37℃（对照组）相比，磁场作用下，细胞的形态没有变化;43℃两种加热手段，30min作用时间内，细胞形态没有变化;48、53℃加热细胞形态改变呈现时间和温度依赖性。磁场对细胞增殖和凋亡诱导没有作用(P＞0.05)，43℃两种加热手段，30min作用时间内，细胞增殖和凋亡诱导没有作用;48、53℃加热细胞增殖明显抑制，细胞凋亡坏死率明显增加，呈现时间和温度依赖性(P＜0.05)。最大抑制率出现的时间点分别是:48℃，20min;53℃，10min;最大细胞凋亡坏死率出现的时间点分别是:48℃，30min;53℃，20min; TUNEL
　　结果显示:磁场作用下，细胞核着染没有明显变化;两种加热手段，43℃细胞核着染随作用时间的延长明显增加;48℃加热，着染细胞核有一个突然减少时间点，水浴加热和磁感应加热出现的时间点分别为:10min和15min;53℃则都是5min后细胞核就大量减少。在这个时间点之后，细胞凋亡坏死率和着染的细胞核数目还会随时间延长而增加。
　　结论：当前磁场对细胞没有影响;43℃两种加热手段，30min作用时间内，细胞形态、增殖抑制率和凋亡坏死诱导率没有影响;48、53℃则可明显抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡、坏死，呈时间和温度依赖性，48℃，30min;53℃，20min，细胞增殖抑制和凋亡坏死诱导可达最大效果平台，可作为动物实验及临床研究的应用参考。TUNEL免疫细胞化学凋亡染色，磁场不增加细胞核着染，两种加热手段，43℃着染细胞核数量明显增加而MTT及流式细胞术未体现可能与凋亡逆转有关;48、53℃均有着染细胞核突然下降的形态学改变时间点，结合流式细胞术和MTT结果，可能是细胞凋亡逆转抑制的阈值点。
　　同一细胞群落中的细胞对热的敏感性存在差异，有对热敏感的细胞，也有对热耐受的细胞，这种细胞的耐热机制及如何防治有待进一步研究。
　　第二部分支架磁感应热疗急性期安全性评价
　　目的:探讨支架磁感应热疗对猪食管的急性期影响。
　　方法:贵州小型猪11只，分5组，分别为正常组（1只）、支架植入组（1只）、43℃、48℃、53℃支架磁感应加热组每组3只。正常猪直接处死，支架植入组在植入支架2h后处死。将热电偶固定于支架表面后用硬食管镜将支架植入猪食管内，按气管切开的操作找到食管外壁，并将热电偶固定其上。手术后，将猪放置于交变磁场中，测试并记录食管内外壁温度。
　　结果:不同的磁场参数条件下，食管内43℃、48℃、53℃均可以实现并维持长时间平衡，相应的磁场参数为:初始应用电流31A，温度升至43℃时转为20A维持;初始应用电流45A，温度升至49℃时转为23A维持;初始应用电流45A，温度升至54-55℃时转为35A维持，三组测试磁芯间隙均为360mm，温度维持平衡时间30min。食管外壁则升温幅度低，最高不超过40℃，外部磁场停止后，温度恢复正常不超过15min。猪呕吐之后，食管内外壁升温曲线发生显著变化，两曲线几乎重合，最大温差只有4℃。食管组织切片显示:支架和43℃对食管没有影响，48食管粘膜下组织会充血，53℃食管粘膜会剥脱形成水泡，粘膜下组织间隙出血。
　　结论:急性期48℃、30min组织呈可逆性改变，可作为在体肿瘤治疗的参考参数。
　　第三部分磁流体磁感应热疗对兔食管移植癌模型的影响
　　目的:探讨磁流体磁感应热疗(Magnetic fluid hyperthermia，MFH)对兔食管移植癌模型的影响。
　　方法用兔XV2肝肿瘤细胞建立兔食管移植癌模型，将氨基硅烷修饰的磁流体(Mangetic nanopartilces modified by aminosilane，amino-MNPs)直接注入肿瘤组织内，在交变磁场中进行磁感应热疗，参数为48℃、30min，每3天重复1次，直至兔死亡，以未处理组、单纯磁流体组为对照。观察兔饮食习惯改变、体重变化、全身重要脏器转移情况、肿瘤体积及生存期，兔死后组织切片HE染色，观察组织形态学改变。
　　结果:在交变磁场中，肿瘤中心温度可达到48℃并维持30min，加热中止后10min温度恢复至正常，所有兔在种植肿瘤后14天出现不同程度的吞咽困难，接种肿瘤后所有兔体重逐渐下降，下降达到原体重70％左右兔会因为营养不良而死亡。组间各时间点的两两比较表明，组间并无显著性差异(P＞0.05)。所有组均有2-3只出现肺转移，未处理组、单纯磁流体组肿瘤体积及生存期比较无显著性差异(P＞0.05)，热疗组在热疗后第7日与其他两组比较肿瘤体积无显著性差异(P＞0.05)，热疗后第14天肿瘤体积小于其他两组(P＜0.05).热疗组生存期比其他两组长(P＜0.05)。组织切片显示，48℃，30min食管内多次热疗不会造成永久性热损伤。
　　结论:兔食管移植癌模型48℃，30min磁感应多次复反热疗是安全和有效的，延长了荷瘤兔的生存期，可以作为临床应用参考。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 支架磁感应热疗对人类食管癌细胞系ECA-109的体外研究

第一节 支架磁感应热疗的温度实现

1．1．1 前言

1．1．2 材料和方法

1．1．3 结果

1．1．4 讨论

1．1．5 小结

第二节 支架磁感应热疗对人类食管癌细胞系ECA-109形态、增殖和凋亡的影响

1．2．1 前言

1．2．2 材料和仪器

第一小节 支架磁感应热疗对Eca-109细胞形态的影响

第二小节 支架磁感应热疗对细胞增殖抑制的影响

第三小节 支架磁感应热疗对ECA-109细胞凋亡和坏死率影响

第四小节 TUNEL法检测支架磁感应热疗诱导ECA-109细胞凋亡

第二部分 支架磁感应热疗食管急性期安全性评价

2．1 前言

2．2 实验材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三部分 磁流体磁感应热疗对兔食管移植癌模型的影响

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

4．5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间主要研究成果