miR-34a在癫痫持续状态后大鼠海马神经元凋亡发生中的作用

摘要

目的：
　　 观察大鼠癫痫持续状态（status epilepticus，SE）后海马区脑组织miR-34a的表达分布规律;通过干预miR-34a表达水平，探讨其在癫痫后海马神经元凋亡中的作用。
　　 方法：
　　 1.建立模型:采用6～8周龄健康雄性SD大鼠，随机分为空白对照组(Normal，N组)，癫痫组(Epilepsy，Ep组)，干预组(Antagomir，A组)和干预对照组（Antagomir-control，C组）。对EP组、A组、C组建立氯化锂一匹罗卡品致痫大鼠SE模型。在SE诱导成功后4-6小时分别对A组和C组侧脑室立体定向给予Antagomir和Antagomir-control干预miR-34a表达水平，各组均以在1天（24小时，急性期）、7天（静止期）作为研究时间点。
　　 2.对大鼠行脑电图检查，记录生理状态、致痫期Ⅳ级以上发作状态、造模成功后发作间期状态、自发发作状态的脑电变化，确认癫痫模型的建立。
　　 3.实时定量-PCR检测各组miR-34a表达水平，检测干预前后miR-34a表达量的变化，以验证药物干预miR-34a的效果。
　　 4.采用Western Blot和免疫组化技术检测caspase-3蛋白在大鼠海马组织中的分部及其表达量的变化。
　　 5.TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick-end-labeling)法检测大鼠SE后海马区脑组织神经元细胞凋亡情况。
　　 6.Nissl染色研究大鼠SE后海马区脑组织神经元细胞缺失及存留情况。
　　 结果：
　　 1.依据动物行为学表现及脑电图结果，最终造模组（Ep组、A组、C组）大鼠成模率为89.17％。成模及干预后，大鼠因自身恢复、麻醉意外、手术创伤等因素，部分发生死亡，最终可用实验组动物的成活率为69.17％。
　　 2.实时定量PCR检测显示，在急性期和静止期，miR-34a的表达在Ep组较N组均显著增高，药物干预后A组较C组均显著降低，有显著性差异，干预有效。
　　 3.Western Blot检测显示，在急性期和静止期，caspase-3蛋白的表达在Ep组较N组均显著增高，药物干预后A组较C组均显著降低，有显著性差异，与实时定量PCR结果趋势相一致。
　　 4.免疫组化检测显示，在急性期和静止期，Ep组与药物干预对照C组中caspase-3蛋白在海马（CA1、CA3区）神经元胞浆均高表达，而N组和药物干预A组均仅有较低密度的表达，与Western Blot结果相一致。
　　 5.TUNEL检测显示，在急性期和静止期，Ep组海马(CA1、CA3区）神经元细胞凋亡均明显多于N组;药物干预后A组海马(CA1、CA3区)神经元细胞凋亡均明显低于C组，与实时定量PCR、WesternBlot、免疫组化结果相一致。
　　 6.Nissl染色显示，在急性期和静止期，Ep组海马(CA1、CA3区)神经元细胞损失均明显多于N组，存留的神经元细胞均明显少于N组;药物干预后A组海马（CA1、CA3区）神经元细胞损失均明显少于C组，存留的神经元细胞均明显多于N组，与实时定量PCR、Western Blot、免疫组化、TUNEL结果相适应。
　　 结论：
　　 大鼠癫痫持续状态后的急性期和静止期，海马（CA1、CA3区）神经元中miRNA-34a可通过上调caspase-3蛋白的表达，激活下游凋亡通路，造成海马区神经元细胞凋亡。

目录

声明

摘要

缩写词

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1 主要仪器和试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．1．3 器材和试剂准备

2．2 实验动物及分组

2．3 动物模型的制备

2．3．1 药物致痫

2．3．2 脑电图记录

2．3．3 立体定向

2．4 标本的制备

2．4．1 分子生物学标本的制备

2．4．2 形态学标本的制备

2．5 实验方法

2．5．1 实时定量PCR

2．5．2 Western blot

2．5．3 免疫组化

2．5．4 TUNEL

2．5．5 Niss1染色

第三章 实验结果

3．1 实验大鼠造模结果

3．1．1 药物致痫

3．1．2 脑电图

3．2 实时定量PCR结果

3．3 Western blot

3．4 免疫组化

3．5 TUNEL

3．6 Niss1染色

第四章 讨论

4．1 Antagomir干预miRNA水平的原理及应用

4．2 caspase-3在大鼠SE及干预后表达情况

4．3 大鼠SE及干预后神经元损失情况

第五章 结论

参考文献

综述

致谢